Giai đoạn III Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.3. Giai đoạn III Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Quá trình thích nghi ở đây là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lí và giải phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy lá do nắng [5].

1.4. Một số thành tựu nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật được áp dụng ngày càng rộng rãi trên thế giới và trong nước. Trên thế giới, hiện nay có hàng loạt các công ty về nhân giống in

vitro cây trồng thương mại với quy mô lớn. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã thực sự

mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật [18].

Ở Việt Nam, từ những năm 1960 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã du nhập vào nước ta bắt đầu tại miền Nam. Đến đầu những năm 1970 đã có tại miền Bắc. Hiện nay, các hướng nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triển mạnh. Nhân giống thương mại với quy mô lớn đã được áp dụng như nhân nhanh giống đu đủ [20], nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh [19],…Ngoài ra còn sử dụng để nhân nhanh các loài cây trồng, các loài hoa như hoa Loa Kèn [22], hoa Đồng Tiền [12].

Đối với tài nguyên cây thuốc, việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng. Cây thuốc không chỉ có giá trị trực tiếp để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lí thì đó còn là nguồn thu nhập trong phạm vi gia đình và cộng đồng địa phương. Hiện nay, nhiều loại cây thuốc

của nhân giống in vitro, nhiều nhà nghiên cứu đã công bố nhiều thành tựu

nhân giống cây thuốc quý, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp nuôi cấy in vitro của tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh và

Dương Huyền Trang (2008) đã cho thấy, để tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Lô hội nên sử dụng mẫu ở vụ xuân, khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút cho hiệu quả khử trùng cao (68,5%). Môi trường MS bổ sung BAP 2,5mg/l cho hệ số nhân chồi cao (5,3 lần/ 3 tuần), chất lượng chồi tốt. Bổ sung than hoạt tính 1,5 - 2g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất, tỷ lệ ra rễ đạt 100%, chất lượng rễ tốt. Giá thể thích hợp cho cây là cát mịn, tỷ lệ sống cao (81,4%) cây sinh trưởng phát triển tốt [17].

Nhóm nghiên cứu Lê Tiến Vinh và CS (2014) đã nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), kết quả cho

thấy: Trên môi trường MS + GA3 1,0 mg/l đã nhận được 40,43% hạt Đan sâm nảy mầm sau 2 tuần. Đoạn thân (kích thước 2-3 cm và có một cặp lá) cắt từ cây Đan sâm nảy mầm được sử dung làm vật liệu nhân nhanh. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (5,05 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + BAP, NAA, IAA, IBA 0,5 mg/l đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành rễ của chồi in vitro. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường MS có bổ sung IAA 0,75 mg/l, cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/cây sau 4 tuần nuôi cấy. Cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích hợp để chuyển ra ngoài vườn ươm. Trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát, tỷ lệ sống đạt 100%, cây sinh trưởng phát triển tốt [21].

Tam thất là cây dược liệu quý có tác dụng hóa ứ, cầm máu, tiêu sưng, giảm đau. Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và CS (2013) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng

oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và

flavonoid, đồng thời xác định được NAA 2,0 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tâm thất [9].

Nhóm tác giả Nguyễn Thanh Tùng và CS (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro cây Qua lâu (Trichosanthes kirilowii), đã cho thấy, hạt Qua lâu được khử trùng bằng javel trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung kinetin 1,5 mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt không nhiễm có nảy mầm đạt 87,9%. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên in vitro được cấy lên môi

trường nhân nhanh có bổ sung BAP, kinetin, NAA và nước dừa riêng rẽ hay kết hợp. Kết quả nhân chồi tốt nhất đạt được khi nuôi cấy chồi bên trên môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l và 20% nước dừa (19,87 chồi/chồi bên). Chồi in vitro tạo rễ trên môi trường 1/2 MS không bổ sung chất kích thích sinh trưởng (5,67 rễ/chồi). Cây in vitro đạt tiêu chuẩn được chuyển ra đất sau 4

tuần nuôi cấy. Cây con được trồng trên giá thể đất thịt và cát (1:1) cho tỷ lệ sống sót cao nhất đạt 77,5% [15].

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của Nguyễn Việt Cường và CS (2013) cho thấy dịch chiết chuối ở nồng độ 10 g/l, tảo spirulina ở nồng độ 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh. Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng sinh trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro. Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở nồng độ 2,0 mg/l [1].

Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài (2013) đã tiến hành nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng, ánh sáng đèn LED đỏ và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho sự hình thành

Sharma G.J. và CS (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt thân rễ cây địa liền và cây ngải máu, sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc HgCl2 0,2% trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu [29].

Dương Tấn Nhựt và CS (2011) tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc Linh bằng Cồn 70% trong 30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao [25].

Behera k.k. và CS (2010) sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để cảm ứng chồi cây nghệ vàng [24].

Jala a. và CS (2012) nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BAP 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy [26].

Sen a. và CS (2010) khi chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và

cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên [28].

Shahinozzaman m và CS (2013) chuyển cây con tái sinh in vitro

sang chậu nhựa có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi. Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao [30].

Nayak s. và CS (2010) nghiên cứu nhân giống trên cây Địa liền cho thấy, ở trong môi trường MS kết hợp BAP (1,0 - 5,0 mg/l) cho kết quả nhân chồi tốt nhất ở BAP 1,0 mg/l với hệ số nhân chồi là 5,0 ± 0,3 chồi và chiều cao chồi là 10,2 ± 0,3 cm. Khi bổ sung BAP từ 1,0 - 3,0 mg/l và IBA từ 0,5 - 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất ở BAP 1,0 mg/l và IBA 0,5 mg/l với 11,5 ± 0,5 chồi và chiều cao chồi là 10,8 ± 0,6 cm [27].

Đối với cây Thổ nhân sâm hiện nay các tài liệu nghiên cứu còn rất hạn chế. Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu nhất là dược liệu hoang dại trong thiên nhiên là rất cần thiết, đồng thời là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật. Hy vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn

để có thể xác định được đầy đủ hàm lượng của các hợp chất hóa học, tác dụng dược liệu của cây Thổ nhân sâm. Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn và ứng dụng nhiều hơn của cây Thổ nhân sâm trong y học.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: Hạt Thổ nhân sâm thu ngoài tự nhiên tại huyện Ba Bể - tỉnh Bắc Kạn.

2.1.2. Hoá chất, thiết bị * Hoá chất * Hoá chất

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS gồm khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962).

-Hóa chất khử trùng: HgCl2 (Biobasic, Canada); Javen, cồn… -Chất điều hòa sinh trưởng: BAP, kinetin, IBA (Sigma, Đức). -Hóa chất khác: đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)…

* Thiết bị

Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm: Bình tam giác 250ml, 500 ml, bông, giấy làm nút, giấy thấm, bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, tủ cấy vô trùng (Esco, Đức), nồi hấp khử trùng (Nuarie, Mỹ), tủ sấy (Memmer, Đức)…

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2015 - tháng 4/2016 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Sử dụng môi trường MS bố sung agar 6g/l + đường sucrose 30g/l. - Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50 - 70 ml/bình.

- Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1,1 atm trong 20 phút.

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.2.1. Khử trùng hạt

Lựa chọn hạt Thổ nhân sâm mẩy, chắc, đều nhau rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần. Lắc hạt trong xà phòng loãng trong 5 phút rồi rửa lại dưới vòi nước sạch. Khử trùng box cấy và buồng cấy bằng đèn UV trong khoảng thời gian 45 - 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng. Hạt khử trùng sơ bộ bằng dung dịch cồn 70 % trong 2 phút sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 lần.Tiếp theo, khử trùng bằng HgCl2 0,1% và javel 60%.

* Khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1%

Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 2, 3, 4, 5 phút, sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần. Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và HgCl2

0,1%. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8.

* Khử trùng hạt bằng javel 60%

Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng javel 60% trong khoảng thời gian 10, 15, 20, 25 phút. Sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần. Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và javen 60%. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8.

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần nhắc lại, 150 hạt/công thức.

+ Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm. + Tỉ lệ hạt nhiễm.

+ Tỉ lệ hạt chết. + Hình thái mầm.

2.2.2.2. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Sau khi vào mẫu hạt thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt. Các đoạn thân mang chồi nách của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh. Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ Thổ nhân sâm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy. Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi.

(1) Môi trường nhân chồi

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, tổ hợp BAP + kinetin, tổ hợp BAP + IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi.

Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l.

Nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm trên sẽ được kết hợp với kinetin với nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 2,0 mg/l.

BAP kết hợp với IBA với nồng độ: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5mg/l. Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng. Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức bố trí 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình. Kết quả được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:

+ Khả năng bật chồi: Số chồi/ mẫu. + Chiều cao chồi.

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh .

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh.

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng.

(2) Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường tạo rễ)

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 4 - 5 lá được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng IBA với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức bố trí 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình. Kết quả được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:

+ Tỉ lệ chồi ra rễ. + Số rễ trung bình. + Chiều dài rễ. + Chất lượng rễ:

Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng

Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng. Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng.

2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Vật liệu là cây Thổ nhân sâm con sau nuôi cấy mô. Chọn cây có bộ rễ dài, khỏe, lá xanh, đang thời kì sung sức để đưa ra môi trường tự nhiên. Giá thể là đất thịt trung bình, cát và trấu hun.

Đất thịt mang tính chất trung gian giữa đất cát và đất sét. Tuỳ theo tỷ lệ cát và sét trong đất thịt mà sẽ thiên về hướng có tỷ lệ lớn. Ví dụ: Nếu đất thịt nhẹ thì ngả về phía đất cát, còn đất thịt nặng thì ngả về đất sét. Nhìn chung đất thịt nhẹ và đất thịt trung bình có chế độ nước, nhiệt, không khí điều hoà thuận lợi cho các quá trình lý hoá xảy ra trong đất. Mặt khác, cày - bừa, làm đất cũng nhẹ nhàng. Đa số cây trồng sinh trưởng và phát triển thuận lợi trên loại đất này. Vì vậy nông dân thường ưa thích đất thịt nhẹ và thịt trung bình [4].

Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách: đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cấy. Thời gian này kéo dài