4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro
2.2.2.1. Khử trùng hạt
Lựa chọn hạt Thổ nhân sâm mẩy, chắc, đều nhau rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần. Lắc hạt trong xà phòng loãng trong 5 phút rồi rửa lại dưới vòi nước sạch. Khử trùng box cấy và buồng cấy bằng đèn UV trong khoảng thời gian 45 - 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn. Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng. Hạt khử trùng sơ bộ bằng dung dịch cồn 70 % trong 2 phút sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 lần.Tiếp theo, khử trùng bằng HgCl2 0,1% và javel 60%.
* Khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1%
Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 2, 3, 4, 5 phút, sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần. Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và HgCl2
0,1%. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8.
* Khử trùng hạt bằng javel 60%
Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng javel 60% trong khoảng thời gian 10, 15, 20, 25 phút. Sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần. Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và javen 60%. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8.
Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần nhắc lại, 150 hạt/công thức.
+ Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm. + Tỉ lệ hạt nhiễm.
+ Tỉ lệ hạt chết. + Hình thái mầm.
2.2.2.2. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy
Sau khi vào mẫu hạt thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt. Các đoạn thân mang chồi nách của các cây con nói trên được sử dụng làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh. Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ Thổ nhân sâm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy. Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng nền môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi.
(1) Môi trường nhân chồi
Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, tổ hợp BAP + kinetin, tổ hợp BAP + IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi.
Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l.
Nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm trên sẽ được kết hợp với kinetin với nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 2,0 mg/l.
BAP kết hợp với IBA với nồng độ: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5mg/l. Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng. Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức bố trí 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình. Kết quả được đánh giá sau 8 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:
+ Khả năng bật chồi: Số chồi/ mẫu. + Chiều cao chồi.
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh .
Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh.
Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng.
(2) Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường tạo rễ)
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 4 - 5 lá được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng IBA với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức bố trí 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình. Kết quả được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:
+ Tỉ lệ chồi ra rễ. + Số rễ trung bình. + Chiều dài rễ. + Chất lượng rễ:
Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng
Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng. Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng.
2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên
Vật liệu là cây Thổ nhân sâm con sau nuôi cấy mô. Chọn cây có bộ rễ dài, khỏe, lá xanh, đang thời kì sung sức để đưa ra môi trường tự nhiên. Giá thể là đất thịt trung bình, cát và trấu hun.
Đất thịt mang tính chất trung gian giữa đất cát và đất sét. Tuỳ theo tỷ lệ cát và sét trong đất thịt mà sẽ thiên về hướng có tỷ lệ lớn. Ví dụ: Nếu đất thịt nhẹ thì ngả về phía đất cát, còn đất thịt nặng thì ngả về đất sét. Nhìn chung đất thịt nhẹ và đất thịt trung bình có chế độ nước, nhiệt, không khí điều hoà thuận lợi cho các quá trình lý hoá xảy ra trong đất. Mặt khác, cày - bừa, làm đất cũng nhẹ nhàng. Đa số cây trồng sinh trưởng và phát triển thuận lợi trên loại đất này. Vì vậy nông dân thường ưa thích đất thịt nhẹ và thịt trung bình [4].
Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng cách: đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cấy. Thời gian này kéo dài khoảng 10 ngày, tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây. Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát. Rửa sạch phần thạch bám vào vì đó thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Sau đó để cây chỗ dâm mát rồi đem trồng vào giá thể.
Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nilon có đường kính 7,0 x 11 cm, có đục lỗ dưới đáy. Thành phần ruột bầu chính là các loại giá thể: (1) Đất thịt trung bình, (2) đất thịt trung bình + cát (2:1); (3) đất thịt trung bình + trấu hun (2:1).
Xử lí bầu: Trước khi cấy 1 - 2 ngày, bầu đất được xử lí khử trùng nấm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hòa thuốc tím vào nước và dùng ô doa tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu). Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: Trong 2 - 3 ngày đầu tưới nước sạch bằng cách phun sương 4 lần/ngày (giữ độ ẩm giá thể khoảng 75% - 80%). Trời rét phải che nilon tránh rét và tránh thoát nước nhanh. Nilon phải đục lỗ thoáng khí. Sau 5 ngày có thể bỏ nilon che để cây đủ ánh sáng, thoáng khí. Tưới nước bằng bình phun 2 - 3 lần/ngày. Sau 10 ngày tưới cây bằng dung dịch MS pha loãng với tỉ lệ 1/10, ngày 1 lần. Sau khi cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra đồng ruộng.
Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 cây/công thức.
Đánh giá kết quả sau khi ra cây 4 tuần. Theo dõi các chỉ số sau: + Tỉ lệ cây sống.
+ Chiều cao cây.
2.3. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.
- Nhiệt độ từ 25 - 270C
- Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 – 12 giờ/ngày.
- Môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng sinh trưởng (BAP, kinetin, IBA); pH môi trường 5,6 - 5,8.
- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút ở áp suất 1atm.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [14]. Các phương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh hai mẫu độc lập, nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố, phân tích phương sai hai nhân tố.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên có vai trò quyết định trong sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Nguồn mẫu Thổ nhân sâm đưa
vào là các hạt được lấy ngoài tự nhiên chứa nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp khử trùng thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng
Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2
0,1% với các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy được trình bày trong bảng 3.1.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, khi không sử dụng hóa chất khử trùng thì toàn bộ hạt đã bị nhiễm sau thời gian 20 ngày nuôi cấy. Khi tăng thời gian khử trùng từ 2 - 5 phút thì tỉ lệ hạt nhiễm giảm từ 43,88% xuống 13,64 % còn tỉ lệ hạt chết tăng từ 10,18% đến 24,66%, đặc biệt ở công thức 5 lên đến 32,14%.
Khi sử dụng HgCl2 0,1% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 2 - 3 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm tăng tương ứng từ 45,94% đến 71,78%, mầm mập, xanh bình thường. Tiến hành tăng thời gian khử trùng lên 4 và 5 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm lại giảm tương ứng lần lượt là 59,42% và 54,22%, mầm gầy, vàng.
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm ở các công thức thực sự khác nhau ở độ tin cậy 95%. Sử dụng hàm Anova Single Factor để phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong HgCl2 0,1%) nhằm tìm nguyên nhân của sự sai khác trên, kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ hạt nảy mầm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí HgCl2 0,1%
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng HgCl2 0,1% (sau 20 ngày nuôi cấy)
Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mẫu/CT (mẫu) Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm (%) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Hình thái mầm 1 (ĐC) 0 150 0 100 0 CT 2 2 150 45,94 ± 2,43 43,88 ± 2,24 10,18 ± 2,8 mập, XBT CT 3 3 150 71,78 ± 1,32 16,72 ± 1,81 11,50 ± 1,4 mập, XBT CT 4 4 150 59,42 ± 1,75 15,92 ± 1,50 24,66 ± 1,61 gầy, vàng CT 5 5 150 54,22 ± 1,83 13,64 ± 0,82 32,14 ± 1,7 gầy, vàng
(Ghi chú: XBT: xanh bình thường)
Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi hạt tiếp xúc với HgCl2 0,1% với thời gian thích hợp sẽ cho tỉ lệ mẫu sạch cao, còn thời gian tiếp xúc quá lâu thì tỉ lệ hạt chết nhiều. Công thức 3 là công thức thích hợp nhất trong thí nghiệm với thời gian khử trùng là 3 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt 71,78%, sai khác có ý nghĩa với đối chứng và tỉ lệ hạt chết không quá cao đạt 11,50%, chồi mầm mập, màu xanh bình thường.
3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng javen 60% (sau 20 ngày nuôi cấy)
Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mấu/ CT (mẫu) Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm (%) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Hình thái mầm 1 (ĐC) 0 150 0 100 0 CT 2 10 150 43,74 ± 2,44 45,56 ± 2,54 10,7 ± 2,5 mập, XBT CT 3 15 150 70,02 ± 0,52 18,32 ± 1,56 11,66 ± 1,35 mập, XBT CT 4 20 150 58,46 ± 1,77 17,12 ± 1,07 24,42 ± 1,27 gầy, vàng CT 5 25 150 51,56 ± 2,00 14,04 ± 0,84 34,40 ± 1,58 gầy, vàng
(Ghi chú: XBT: xanh bình thường)
Sử dụng hàm Anova Single Factor để phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong javel 60% ) kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ hạt nảy mầm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí javel 60%. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, khi không sử dụng hóa chất khử trùng thì toàn bộ hạt đã bị nhiễm sau thời gian 20 ngày nuôi cấy. Trong bảng trên chỉ tiêu tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm là quan trọng nhất. Sử dụng javel 60% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 10 - 15 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm cũng tăng tương ứng từ 43,74% đến 70,02%, mầm mập, xanh bình thường. Tiến hành tăng thời gian khử trùng lên 20 và 25 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm lại giảm tương ứng lần lượt là 58,46% và 51,56%, mầm gầy, vàng. Mặt khác, khi tăng thời gian khử trùng từ 10 - 20 phút thì tỉ lệ hạt chết tăng từ 10,7% đến 24,42%, đặc biệt ở công thức 5 lên đến 34,40%. Điều này chứng tỏ, khi hạt tiếp xúc với javel 60% với thời gian thích hợp sẽ cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao, chất lượng mầm tốt, còn thời gian tiếp xúc với hóa chất khử trùng càng lâu thì tỉ lệ hạt chết càng cao, chất lượng mầm giảm. So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích
cho thấy sự sai khác về tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm ở công thức 3 và công thức 5 là thực sự có ý nghĩa, độ tin cậy 95%.
Vì vậy Công thức 3 là công thức tốt nhất trong thí nghiệm với thời gian khử trùng là 15 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt 70,02% và tỉ lệ hạt chết không quá cao đạt 11,66%, chồi mầm mập, màu xanh bình thường.
Qua các số liệu thu được ở bảng 3.1, 3.2 ta thấy: Các hóa chất khử trùng khác nhau thì cho tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm, tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết, hình thái mầm khác nhau rõ rệt.
So sánh kết quả khử trùng hạt cho thấy khử trùng hạt bằng HgCl2
0,1% trong 3 phút cho hiệu quả khử trùng tốt hơn với tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm 71,78% và tỷ lệ chết 11,50%. Khử trùng hạt bằng javel 60% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm 70,02%; tỷ lệ chết 11,66%. Tuy nhiên, sự chênh lệch hiệu quả khử trùng giữa hai công thức này không đáng kể. Thủy ngân là một kim loại nặng rất độc. Do vậy, nên sử dụng dung dịch javen 60% để khử trùng mẫu vật. Công thức khử trùng phù hợp là: Trong cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó khử trùng trong javen 60% trong 15 phút và được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy lên môi trường.
Khử trùng bằng dung dịch javel 60% Khử trùng bằng HgCl2 0,1%
Hình 3.1. Kết quả khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% và dung dịch javel 60% (sau 20 ngày)
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm
Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Đây là giai đoạn quan trọng quyết định số lượng cây trong quá trình nuôi cấy in vitro. Số chồi/mẫu càng cao thì khả năng nhân giống càng
lớn. Số chồi/mẫu chịu ảnh hưởng lớn của yếu tố tác động là các chất kích