4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [14]. Các phương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh hai mẫu độc lập, nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố, phân tích phương sai hai nhân tố.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên có vai trò quyết định trong sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Nguồn mẫu Thổ nhân sâm đưa
vào là các hạt được lấy ngoài tự nhiên chứa nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp khử trùng thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng
Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2
0,1% với các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy được trình bày trong bảng 3.1.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, khi không sử dụng hóa chất khử trùng thì toàn bộ hạt đã bị nhiễm sau thời gian 20 ngày nuôi cấy. Khi tăng thời gian khử trùng từ 2 - 5 phút thì tỉ lệ hạt nhiễm giảm từ 43,88% xuống 13,64 % còn tỉ lệ hạt chết tăng từ 10,18% đến 24,66%, đặc biệt ở công thức 5 lên đến 32,14%.
Khi sử dụng HgCl2 0,1% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 2 - 3 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm tăng tương ứng từ 45,94% đến 71,78%, mầm mập, xanh bình thường. Tiến hành tăng thời gian khử trùng lên 4 và 5 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm lại giảm tương ứng lần lượt là 59,42% và 54,22%, mầm gầy, vàng.
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm ở các công thức thực sự khác nhau ở độ tin cậy 95%. Sử dụng hàm Anova Single Factor để phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong HgCl2 0,1%) nhằm tìm nguyên nhân của sự sai khác trên, kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ hạt nảy mầm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí HgCl2 0,1%
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng HgCl2 0,1% (sau 20 ngày nuôi cấy)
Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mẫu/CT (mẫu) Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm (%) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Hình thái mầm 1 (ĐC) 0 150 0 100 0 CT 2 2 150 45,94 ± 2,43 43,88 ± 2,24 10,18 ± 2,8 mập, XBT CT 3 3 150 71,78 ± 1,32 16,72 ± 1,81 11,50 ± 1,4 mập, XBT CT 4 4 150 59,42 ± 1,75 15,92 ± 1,50 24,66 ± 1,61 gầy, vàng CT 5 5 150 54,22 ± 1,83 13,64 ± 0,82 32,14 ± 1,7 gầy, vàng
(Ghi chú: XBT: xanh bình thường)
Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi hạt tiếp xúc với HgCl2 0,1% với thời gian thích hợp sẽ cho tỉ lệ mẫu sạch cao, còn thời gian tiếp xúc quá lâu thì tỉ lệ hạt chết nhiều. Công thức 3 là công thức thích hợp nhất trong thí nghiệm với thời gian khử trùng là 3 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt 71,78%, sai khác có ý nghĩa với đối chứng và tỉ lệ hạt chết không quá cao đạt 11,50%, chồi mầm mập, màu xanh bình thường.
3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng javen 60% (sau 20 ngày nuôi cấy)
Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mấu/ CT (mẫu) Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm (%) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Hình thái mầm 1 (ĐC) 0 150 0 100 0 CT 2 10 150 43,74 ± 2,44 45,56 ± 2,54 10,7 ± 2,5 mập, XBT CT 3 15 150 70,02 ± 0,52 18,32 ± 1,56 11,66 ± 1,35 mập, XBT CT 4 20 150 58,46 ± 1,77 17,12 ± 1,07 24,42 ± 1,27 gầy, vàng CT 5 25 150 51,56 ± 2,00 14,04 ± 0,84 34,40 ± 1,58 gầy, vàng
(Ghi chú: XBT: xanh bình thường)
Sử dụng hàm Anova Single Factor để phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong javel 60% ) kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ hạt nảy mầm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí javel 60%. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, khi không sử dụng hóa chất khử trùng thì toàn bộ hạt đã bị nhiễm sau thời gian 20 ngày nuôi cấy. Trong bảng trên chỉ tiêu tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm là quan trọng nhất. Sử dụng javel 60% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 10 - 15 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm cũng tăng tương ứng từ 43,74% đến 70,02%, mầm mập, xanh bình thường. Tiến hành tăng thời gian khử trùng lên 20 và 25 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm lại giảm tương ứng lần lượt là 58,46% và 51,56%, mầm gầy, vàng. Mặt khác, khi tăng thời gian khử trùng từ 10 - 20 phút thì tỉ lệ hạt chết tăng từ 10,7% đến 24,42%, đặc biệt ở công thức 5 lên đến 34,40%. Điều này chứng tỏ, khi hạt tiếp xúc với javel 60% với thời gian thích hợp sẽ cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao, chất lượng mầm tốt, còn thời gian tiếp xúc với hóa chất khử trùng càng lâu thì tỉ lệ hạt chết càng cao, chất lượng mầm giảm. So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích
cho thấy sự sai khác về tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm ở công thức 3 và công thức 5 là thực sự có ý nghĩa, độ tin cậy 95%.
Vì vậy Công thức 3 là công thức tốt nhất trong thí nghiệm với thời gian khử trùng là 15 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt 70,02% và tỉ lệ hạt chết không quá cao đạt 11,66%, chồi mầm mập, màu xanh bình thường.
Qua các số liệu thu được ở bảng 3.1, 3.2 ta thấy: Các hóa chất khử trùng khác nhau thì cho tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm, tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết, hình thái mầm khác nhau rõ rệt.
So sánh kết quả khử trùng hạt cho thấy khử trùng hạt bằng HgCl2
0,1% trong 3 phút cho hiệu quả khử trùng tốt hơn với tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm 71,78% và tỷ lệ chết 11,50%. Khử trùng hạt bằng javel 60% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm 70,02%; tỷ lệ chết 11,66%. Tuy nhiên, sự chênh lệch hiệu quả khử trùng giữa hai công thức này không đáng kể. Thủy ngân là một kim loại nặng rất độc. Do vậy, nên sử dụng dung dịch javen 60% để khử trùng mẫu vật. Công thức khử trùng phù hợp là: Trong cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó khử trùng trong javen 60% trong 15 phút và được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy lên môi trường.
Khử trùng bằng dung dịch javel 60% Khử trùng bằng HgCl2 0,1%
Hình 3.1. Kết quả khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% và dung dịch javel 60% (sau 20 ngày)
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm
Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời gian ngắn. Đây là giai đoạn quan trọng quyết định số lượng cây trong quá trình nuôi cấy in vitro. Số chồi/mẫu càng cao thì khả năng nhân giống càng
lớn. Số chồi/mẫu chịu ảnh hưởng lớn của yếu tố tác động là các chất kích thích sinh trưởng. Mục tiêu nghiên cứu của giai đoạn này là tìm ra môi trường phù hợp để có số chồi/mẫu và chất lượng chồi là tốt nhất cho đối tượng nghiên cứu.
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm nhân chồi Thổ nhân sâm
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, phân hóa chồi bất định. Do cytokinincó khả năng tổng hợp axit nucleic và protein. BAP là một loại cytokinin thường được sử dụng để nhân nhanh chồi trong nuôi cấy in vitro.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm thăm dò nồng độ BAP lần lượt là: 0,0mg/l; 0,5mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l, sử dụng đoạn thân mang chồi nách khoảng 1cm làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh. Theo dõi kết quả trong 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.2.
Kết quả bảng 3.3 cho thấy các công thức có bổ sung BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) không bổ sung BAP. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy: Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt 1,46 chồi. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,82 chồi đến 2,60 chồi. Trong đó công thức 4 với nồng độ BAP bổ sung là 1,5 mg/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 2,60 chồi. Các công thức thí nghiệm 2, 3, 5, 6 cho số chồi/mẫu lần lượt là 1,82 chồi; 1,94 chồi; 1,98 chồi và 1,51 chồi. Khi nồng độ BAP qua ngưỡng tối thích ở công thức 4 thì số chồi/mẫu có xu hướng giảm dần ở công thức 5 và 6.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Tổng số mấu/CT (mẫu) Số chồi/mẫu (chồi) Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 0 50 1,1 ± 0,17 1,88 ± 0,06 ++ CT 2 0,5 50 1,6 ± 0,07 1,54 ± 0,08 ++ CT 3 1,0 50 1,72 ± 0,07 1,44 ± 0,07 +++ CT 4 1,5 50 2,24 ± 0,19 1,32 ± 0,05 +++ CT 5 2,0 50 1,66 ± 0,10 1,24 ± 0,03 ++ CT 6 2,5 50 1,37 ± 0,09 1,11 ± 0,03 + Sau 8 tuần 1 (ĐC) 0 50 1,46 ± 0,29 2,47 ± 0,13 ++ CT 2 0,5 50 1,82 ± 0,18 2,21 ± 0,31 ++ CT 3 1,0 50 1,94 ± 0,17 1,98 ± 0,02 +++ CT 4 1,5 50 2,60± 0,22 1,86 ± 0,09 +++ CT 5 2,0 50 1,98 ± 0,19 1,63 ± 0,14 ++ CT 6 2,5 50 1,51 ± 0,15 1,49 ± 0,12 +
(Ghi chú: chồi tốt: + + +, Chồi trung bình: + +, Chồi kém: +)
Kết quả bảng 3.3 còn cho thấy, khi bổ sung BAP thì chiều cao chồi giảm dần so với công thức đối chứng (không bổ sung BAP). Chiều cao chồi giảm từ 2,21 cm ở công thức 2 đến 1,49 cm ở công thức 6, trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 2,47 cm. So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis (công thức đối chứng và công thức 2). Kết quả phân tích cho thấy sự sai khác về chiều cao chồi là không có ý nghĩa, độ tin cậy 95%. Do đó, lựa chọn công thức đối chứng hoặc công thức 2 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.
Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Trong đó, công thức 2, công thức 5 (nồng độ BAP là 0,5 mg/l, 2,0 mg/l) có chất lượng chồi không khác biệt so với công thức 1 (công thức đối chứng - không bổ sung BAP); công thức 3, 4 cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức tốt; công thức 6 khi nồng độ BAP ở mức cao là 2,5 mg/l cho chất lượng chồi kém (chồi gầy, lá vàng nhạt, xoăn).
Phân tích phương sai một nhân tố kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, số chồi/mẫu ở các công thức khác nhau là do khác nhau về hàm lượng BAP bổ sung vào môi trường. Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu (số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi) thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân nhanh. Do đó có thể kết luận: công thức 4 (bổ sung BAP 1,5 mg/l vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l) là thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 2,60 chồi, sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.
Công thức bổ sung BAP nồng độ 1,5 mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo (BAP kết hợp với kinetin; BAP kết hợp với IBA).
Đối chứng BAP 1,5mg/l
Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năngnhân nhanh chồi Thổ nhân sâm (sau 8 tuần nuôi cấy)
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm
Kinetin là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, nguồn gốc từ dịch chiết ADN biến tính. Kinetin được xem như một chất kích thích nhân tạo đầu tiên của nhóm này được tách chiết và nghiên cứu.
Chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của môi trường bổ sung tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng tạo chồi và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm.
Các môi trường thí nghiệm có bổ sung BAP 1,5 mg/l và kinetin với nồng độ khác nhau 0,0 mg/l; 0,25 mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l; 2,0 mg/l được theo dõi sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy, kết quả thể hiện qua bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l) Tổng số mấu/CT (mẫu) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 1,5 0 50 1,64 ± 0,08 2,02 ± 0,02 ++ CT 2 1,5 0,25 50 1,87 ± 0,03 1,80 ± 0,03 ++ CT3 1,5 0,5 50 2,96 ± 0,10 1,79 ± 0,10 +++ CT4 1,5 1,0 50 1,90 ± 0,10 1,61 ± 0,09 ++ CT5 1,5 2,0 50 1,70 ± 0,10 1,56 ± 0,04 + Sau 8 tuần 1 (ĐC) 1,5 0 50 1,76 ± 0,11 2,60 ± 0,10 ++ CT 2 1,5 0,25 50 1,91 ± 0,04 2,10 ± 0,10 ++ CT3 1,5 0,5 50 3,18 ± 0,07 2,05 ± 0,12 +++ CT4 1,5 1,0 50 2,14 ± 0,14 1,81 ± 1,13 ++ CT5 1,5 2,0 50 1,90 ± 0,28 1,76 ± 0,10 +
Qua bảng 3.4 cho thấy, khi bổ sung BAP 1,5 mg/l và kinetin từ 0,0 mg/l - 1,5 mg/l ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân Sâm.
Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 nhân tố (nồng độ BAP và nồng độ kinetin) và theo bảng xử lý số liệu ở trang 49-50 cho thấy nồng độ BAP không ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi còn hàm lượng kinetin ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi.
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy: Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt 1,76 chồi. Khi tăng nồng độ kinetin từ 0,25 mg/l - 2,0 mg/l cho số chồi/mẫu tương ứng là 1,91 chồi; 3,18 chồi; 2,14 chồi và 1,90 chồi. Trong đó công thức 3 với nồng độ kinetin bổ sung là 0,5 mg/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 3,18 chồi. Khi nồng độ kinetin qua ngưỡng tối thích ở công thức 3 thì số chồi/mẫu có xu hướng giảm dần ở công thức 4 và 5.
Kết quả bảng 3.4 còn cho thấy, khi bổ sung kinetin với nồng độ tăng dần từ 0,25mg/l - 2,0 mg/l thì chiều cao chồi giảm dần so với công thức đối chứng. Chiều cao chồi giảm từ 2,10 cm ở công thức 2 đến 1,76 cm ở công thức 5, trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 2,60 cm. Tuy nhiên, công thức đối chứng và công thức 3 sự sai khác chiều cao chồi là không có ý nghĩa, do đó lựa chọn công thức đối chứng hoặc công thức 3 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.
Chất lượng chồi công thức 2, công thức 4 (nồng độ kinetin là 0,25 mg/l,