4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp
kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm
Kinetin là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, nguồn gốc từ dịch chiết ADN biến tính. Kinetin được xem như một chất kích thích nhân tạo đầu tiên của nhóm này được tách chiết và nghiên cứu.
Chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của môi trường bổ sung tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng tạo chồi và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm.
Các môi trường thí nghiệm có bổ sung BAP 1,5 mg/l và kinetin với nồng độ khác nhau 0,0 mg/l; 0,25 mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l; 2,0 mg/l được theo dõi sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy, kết quả thể hiện qua bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l) Tổng số mấu/CT (mẫu) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 1,5 0 50 1,64 ± 0,08 2,02 ± 0,02 ++ CT 2 1,5 0,25 50 1,87 ± 0,03 1,80 ± 0,03 ++ CT3 1,5 0,5 50 2,96 ± 0,10 1,79 ± 0,10 +++ CT4 1,5 1,0 50 1,90 ± 0,10 1,61 ± 0,09 ++ CT5 1,5 2,0 50 1,70 ± 0,10 1,56 ± 0,04 + Sau 8 tuần 1 (ĐC) 1,5 0 50 1,76 ± 0,11 2,60 ± 0,10 ++ CT 2 1,5 0,25 50 1,91 ± 0,04 2,10 ± 0,10 ++ CT3 1,5 0,5 50 3,18 ± 0,07 2,05 ± 0,12 +++ CT4 1,5 1,0 50 2,14 ± 0,14 1,81 ± 1,13 ++ CT5 1,5 2,0 50 1,90 ± 0,28 1,76 ± 0,10 +
Qua bảng 3.4 cho thấy, khi bổ sung BAP 1,5 mg/l và kinetin từ 0,0 mg/l - 1,5 mg/l ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân Sâm.
Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 nhân tố (nồng độ BAP và nồng độ kinetin) và theo bảng xử lý số liệu ở trang 49-50 cho thấy nồng độ BAP không ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi còn hàm lượng kinetin ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi.
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy: Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt 1,76 chồi. Khi tăng nồng độ kinetin từ 0,25 mg/l - 2,0 mg/l cho số chồi/mẫu tương ứng là 1,91 chồi; 3,18 chồi; 2,14 chồi và 1,90 chồi. Trong đó công thức 3 với nồng độ kinetin bổ sung là 0,5 mg/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 3,18 chồi. Khi nồng độ kinetin qua ngưỡng tối thích ở công thức 3 thì số chồi/mẫu có xu hướng giảm dần ở công thức 4 và 5.
Kết quả bảng 3.4 còn cho thấy, khi bổ sung kinetin với nồng độ tăng dần từ 0,25mg/l - 2,0 mg/l thì chiều cao chồi giảm dần so với công thức đối chứng. Chiều cao chồi giảm từ 2,10 cm ở công thức 2 đến 1,76 cm ở công thức 5, trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 2,60 cm. Tuy nhiên, công thức đối chứng và công thức 3 sự sai khác chiều cao chồi là không có ý nghĩa, do đó lựa chọn công thức đối chứng hoặc công thức 3 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.
Chất lượng chồi công thức 2, công thức 4 (nồng độ kinetin là 0,25 mg/l, 1,0 mg/l) có chất lượng chồi không khác biệt so với công thức 1 (công thức đối chứng - không bổ sung kinetin); công thức 3 cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức tốt; công thức 5 khi nồng độ kinetin ở mức cao là 2,0 mg/l cho chất lượng chồi kém (chồi gầy, lá vàng nhạt, xoăn).
Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu (số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi) thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân nhanh. Sự sai khác số chồi/mẫu ở công thức 3 so với công thức 5 thực sự có ý nghĩa. Do đó có thể kết luận: Công thức 3 (bổ sung BAP 1,5 mg/l + kinetin 0,5 mg/l vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l) là thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 3,18 chồi, sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.
Đối chứng BAP 1,5 mg/l +kinetin 0,5mg/l
Hình 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm (sau 8 tuần nuôi cấy)
3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA tới
khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm
Hàm lượng BAP tối ưu ở thí nghiệm 3 (BAP 1,5 mg/l) sẽ được kết hợp với IBA với các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi cây Thổ nhân sâm. Kết quả sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.4.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Tổng số mấu/CT (mẫu) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần 1 (ĐC) 1,5 0 50 1,16 ± 0,15 1,84 ± 0,07 ++ CT 2 1,5 0,5 50 1,73 ± 0,04 1,71 ± 0,08 ++ CT3 1,5 1,0 50 1,94 ± 0,04 1,66 ± 0,06 +++ CT4 1,5 1,5 50 1,52 ± 0,15 1,43 ± 0,03 + Sau 8 tuần 1 (ĐC) 1,5 0 50 1,36 ± 0,21 2,38 ± 0,26 ++ CT 2 1,5 0,5 50 1,91 ± 0,05 2,18 ± 0,13 ++ CT3 1,5 1,0 50 2,36 ± 0,19 2,06 ± 0,20 +++ CT4 1,5 1,5 50 1,72 ± 0,09 1,87 ± 0,13 +
Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 nhân tố (nồng độ BAP và nồng độ IBA) và theo bảng xử lý số liệu ở trang 50 - 51 cho thấy nồng độ BAP không ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi; hàm lượng IBA ảnh hưởng tới số chồi/mẫu còn không ảnh hưởng tới chiều cao chồi.
Xét chỉ tiêu số chồi/mẫu ta thấy ở công thức 1 (công thức đối chứng) cho số chồi/mẫu 1,36 chồi. Khi giữ nguyên BAP 1,5 mg/l và nồng độ IBA tăng 0,5 mg/l - 1,0 mg/l số chồi/mẫu tăng 1,91 chồi - 2,36 chồi, chất lượng chồi tăng từ trung bình đến tốt. Khi tăng nồng độ IBA lên 1,5 mg/l số chồi/mẫu giảm xuống còn 1,72 chồi, chất lượng chồi kém. Công thức 3 cho số chồi/mẫu cao nhất 2,36 chồi. Sự sai khác số chồi/mẫu ở công thức 3 so với công thức 1 thực sự có ý nghĩa, chiều cao chồi ở mức trung bình 2,06 cm và chất lượng chồi tốt. Vậy công thức 3 với BAP 1,5 mg/l + IBA 1,0 mg/l bổ sung vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l là công thức thích hợp nhất trong thí nghiệm.
Đối chứng BAP 1,5 mg/l + IBA 1,0 mg/l
Hình 3.4. Ảnh hưởngcủa hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả năng nhân chồi cây Thổ nhân sâm (sau 8 tuần nuôi cấy)
Sau khi nghiên cứu kết quả ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm thì môi trường thích hợp nhất cho sự nhân chồi và sinh trưởng của cây Thổ nhân sâm trong ống nghiệm là: MS cơ bản + đường sucrose 30g/l + agar 6,0g/l + BAP 1,5mg/l + kinetin 0,5 mg/l.
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi cây Thổ nhân sâm cây Thổ nhân sâm
Trước khi đưa cây Thổ nhân sâm ra trồng ngoài vườn ươm, chồi Thổ nhân sâm phải trải qua giai đoạn tạo rễ nhờ việc bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin. IBA là một trong những chất gây hiệu ứng rõ nét nhất đối với sự phân hóa tế bào đã được kiểm chứng, đó là khả năng phát sinh rễ. Đây là một trong những giai đoạn quan trọng, quyết định thành công của cả quá trình nghiên cứu, chồi Thổ nhân Sâm phải có rễ mới có khả năng tự hút chất dinh dưỡng ngoài môi trường tự nhiên để sinh trưởng và phát triển.
Để kích thích sự ra rễ chồi Thổ nhân sâm trong nuôi cấy, chúng tôi bố trí các công thức thí nghiệm thăm dò IBA ở các nồng độ khác nhau lần lượt 0,0 mg/l; 0,5mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Theo dõi kết quả trong 2 tuần, 4 tuần nuôi cấy. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.5.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của của IBA đến khả năng ra rễ chồi Thổ nhân sâm
Công thức Nồng độ IBA (mg/l) Tổng số mấu/ CT (mẫu) Tỉ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình (rễ/chồi) Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ Sau 2 tuần 1 (ĐC) 0 50 25,02 ± 1,30 1,46 ± 0,17 1,28 ± 0,09 ++ CT 2 0,5 50 52,54 ± 1,10 2,08 ± 0,30 1,74 ± 0,08 +++ CT 3 1,0 50 56,02 ± 1,84 2,73 ± 0,13 1,86 ± 0,05 +++ CT 4 1,5 50 70,02 ± 1,39 3,02± 0,24 2,12 ± 0,08 ++ CT 5 2,0 50 51,98 ± 1,84 2,58 ± 0,16 1,78 ± 0,07 + Sau 4 tuần 1 (ĐC) 0 50 30,38 ± 0,41 1,62 ± 0,11 1,58 ± 0,06 ++ CT 2 0,5 50 60,06 ± 0,06 2,34 ± 0,23 1,86 ± 0,06 +++ CT 3 1,0 50 65,36 ± 1,32 2,92 ± 0,05 2,08 ± 0,14 +++ CT 4 1,5 50 80,16 ± 0,80 4,02 ± 0,09 2,56 ± 0,07 ++ CT 5 2,0 50 54,90 ± 0,33 2,71 ± 0,09 1,91 ± 0,01 + (Ghi chú: Rễ tốt: +++, Rễ trung bình: ++, Rễ kém: +
Qua bảng 3.6 cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ ở tất cả các công thức tương đối ổn định. Ở công thức 1(đối chứng) tỷ lệ ra rễ 30,38%. Khi tăng nồng độ IBA từ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l tỷ lệ ra rễ tăng dần từ 60,06% - 80,16%. Trong đó, cao nhất là công thức 4 với nồng độ IBA 1,5 mg/l tương ứng với tỷ lệ ra rễ là 80,16%. Khi tăng nồng độ IBA lên 2,0 mg/l tỷ lệ ra rễ giảm còn 54,90% và số rễ trung bình cũng giảm xuống 2,71 cm, chất lượng rễ kém. Như vậy nồng độ IBA quá cao đã làm ức chế tỷ lệ ra rễ. Chiều dài rễ tăng theo nồng độ IBA từ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l tương ứng 1,86 cm; 2,08 cm; 2,56 cm và giảm xuống 1,91 cm khi nồng độ IBA 2,0 mg/l. Sự sai khác về số rễ trung bình giữa các công thức so với công thức đối chứng là không có ý nghĩa. Tỷ lệ ra rễ ở công thức 4 (IBA 1,5 mg/l) cao nhất, số rễ trung bình 4,02, chiều dài rễ 2,56 cm và chất lượng rễ tốt nhất là công thức phù hợp cho sự ra rễ chồi Thổ nhân sâm.
Đối chứng IBA 1,5 mg/l IBA 1,5 mg/l
Hình 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm (sau 4 tuần nuôi cấy)
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm
Lựa chọn giá thể phù hợp để ra cây ngoài vườn ươm là một khâu phải thực hiện tỉ mỉ và thận trọng. Giá thể phù hợp là giá thể cho tỉ lệ cây sống cao,
cây sinh trưởng, phát triển tốt. Vì vậy, thành công của giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng quyết định tới hiệu quả nhân giống.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển cây Thổ nhân sâm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 3 loại giá thể là: Đất thịt trung bình; Đất thịt trung bình + cát (2:1); Đất thịt trung bình + trấu hun (2:1). Qua 4 tuần theo dõi đánh giá, kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.7 và hình 3.9.
Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm (sau 4 tuần)
Công thức Giá thể Tổng số cây/CT (cây) Tỉ lệ cây sống (%) Chiều cao cây (cm) 1 (ĐC) Đất thịt trung bình 150 64,18 ± 0,96 12,76 ± 0,81 CT 2 Đất thịt trung bình + cát (2:1) 150 75,98 ± 0,55 13,66 ± 0,67 CT 3 Đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) 150 87,52 ± 1,67 14,12 ± 0,91
Bảng 3.7 thể hiện kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con. Đất thịt trung bình cho tỷ lệ cây sống 64,18%; giá thể đất thịt trung bình + cát (2:1) cho tỷ lệ cây sống 75,98% và cao nhất là giá thể đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) với tỷ lệ cây sống 87,52%. So sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis cho kết quả sai khác về chiều cao cây trong các thí nghiệm không có ý nghĩa. Vì vậy, đánh giá ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm thì chỉ tiêu tỷ lệ cây sống là quan trọng nhất. Công thức 3 với giá thể là đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) là công thức thích hợp (tỷ lệ cây sống là 87,52%, chiều cao cây 14,12cm) cho
Đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) Đất thịt trung bình + Cát (2:1)
Đất thịt trung bình
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1. Công thức khử trùng phù hợp đối với hạt Thổ nhân sâm là: Trong cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó khử trùng trong javen 60% trong 15 phút và được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng trước khi cấy lên môi trường.
2. Môi trường thích hợp nhất cho sự nhân chồi và sinh trưởng của cây Thổ nhân sâm trong ống nghiệm là: MS cơ bản + đường sucrose 30g/l + agar 6,0g/l + BAP 1,5mg/l + kinetin 0,5 mg/l.
3. Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm là: MS cơ bản + đường sucrose 30g/l + agar 6/l + IBA 1,5 mg/l.
4. Giá thể thích hợp cho cây con sau in vitro là đất thịt trung bình +
trấu hun (2:1) cho tỷ lệ sống đạt 87,52%.
2. Đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng khác đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Thổ nhân sâm.
- Nghiên cứu thêm giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây con in vitro.
- Ứng dụng môi trường thích hợp vào nhân giống cây Thổ nhân sâm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh cây Thổ nhân sâm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Việt Cường, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hà Thị Mỹ Ngân, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013), “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha ET Grushv.) nuôi cấy in vitro”, Báo cáo khoa học - Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học tự nhiên và
công nghệ, tr. 727-731.
2. Nguyễn Thúy Dần (2007), Giáo trình dược liệu, NXB Hà Nội.
3. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4, NXB giáo dục.
4. Nguyễn Thế Đặng, Đặng Văn Minh, Nguyễn Thế Hùng (2007), Giáo trình vật lý đất, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
5. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học,
NXB Đại học Huế.
6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. 7. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB
Nông nghiệp Hà Nội.
8. Minh Phúc (2013), Thảo dược quý và phương thuốc chủ trị, NXB Y học. 9. Vũ Thị Bạch Phượng, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi văn Lệ (2013),
“Nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính oxi hóa của cây Thổ tam thất (Gynura pseudochina (L) DC)”, Báo cáo khoa học - Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học tự
nhiên và công nghệ, tr.1006 - 1010.
10. Hoàng Văn Sỹ (2010), Cẩm nang về lý luận và chẩn trị y học cổ truyền
11. Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Nam, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Dương Tấn Nhựt (2013), “Nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha ET Grushv.)”, Báo