3. Nô ̣i dung nghiên cứu
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI ̣
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don) được thu thập tại hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên. Hai mẫu dừa ca ̣n hoa màu hồng tím (ký hiệu
Giang; hai mẫu dừ a ca ̣n hoa màu hồng tím (ký hiệu là TIM_TN) và dừa ca ̣n hoa trắng đỏ (ký hiệu là TRANG_TN).
2.1.2. Hóa chất, thiết bị và máy móc
Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử như: Tris HCl, EDTA, phenol, ethanol (100%), agarose... thuộc các hãng: Merck, Sigma, Biolabscasc của các nước nước Mỹ, Anh, Đức. Ngoài ra còn một số hóa chất khác.
Các thí nghiệm được tiến hành trên các trang thiết bị như bộ nguồn điện di NanoPAC - 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800, Nhật Bản, một số thiết bị khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic của Nhật Bản), tủ lạnh -85oC (Nuaire của Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng và một số thiết bị khác.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Thu thập mẫu dừa cạn có hoa màu hồng tím và hoa trắng ở khu vực thành phố Hà Giang và thành phố Thái Nguyên, cây dừa cạn được chọn đều là các cây khỏe mạnh, hoa đẹp. Tiến hành trồng các cây này ở một địa điểm thích hợp có cường độ ánh sáng vừa đủ, tưới nước hàng ngày với lượng nước như nhau. Sau một thời gian, thu hoạch lá non để tiến hành tách DNA. Sau khi thu, mẫu lá được làm sạch bằng cồn và nước cất sau đó được cho vào túi nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -80oC để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu.
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ lá non của các mẫu giống dừa cạn sử dụng hóa chất CTAB. Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước như sau:
Bước 1. Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (– 1960C) thành bột mịn. Bổ sung vào mẫu 600µl đệm rửa có thành phần (Tris – HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 5mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước). Chia ra 4 ống Eppendorf 1,5ml. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC, bỏ dịch, thu cặn. ( Bước này lặp lại 2 lần).
Bước 2. Thêm vào mỗi ống 500 µl đệm chiết ( bao gồm các thành phần: Tris – HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 20mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; nước), trộn nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65ºC trong vòng 2 giờ (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần). Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Bước 3. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC. Thu dịch pha trên chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
Bước 4. Bổ sung thêm 500µl cloroform : isoamyl alcohol (24 cloroform : 1 isoamyl alcohol) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC. Hút cẩn thận 500µl dịch trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5µl mới (bỏ tủa). Bước này lặp lại 2 lần. Bước 5. Thêm 500µl isopropanol, trộn nhẹ, tủa DNA ở -20ºC để qua đêm. Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại dịch thu tủa.
Bước 6. Bổ sung 500µl cồn 70 độ. Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần). Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50µl nước cất 2 lần đã khử trùng. Bảo quản ở tủ -200C đến khi sử dụng.
2.2.2.2. Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR
Bước 1. Nhân gen rpoC1 bằng kỹ thuật PCR
Tham khảo công bố củ a Peter và cs (2011) và bảng các că ̣p mồi DNA Barcoding [37], cặp mồi rpoC1-1F/rpoC1-3R được tổng hợp có trình tự nucleotide như sau:
rpoC1-1f: 5’-GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’ rpoC1-3r: 5’-TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC-3’
Đoạn gen rpoC1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r với kích thước dự kiến là khoảng 508 nucleotide.
Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1
STT Thành phần Nồng độ Thể tích(l)
1 PCR Masster Mix 2X 7,5
2 Mồi xuôi 10 pmol/l 0,5 3 Mồi ngược 10 pmol/l 0,5
4 DNA khuôn 10ng/μl 0,5
5 Nước khử ion - 6,0
Tổng thể tích 15
Chu trình nhiệt và thời gian hoạt động của máy PCR bao gồm: Biến tính khởi động ở 94oC trong 4 phút; lặp lại 35 chu kì với (biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55oC trong 40 giây, tổng hợp và kéo dài ở 72oC trong 40 giây); ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút và bảo quản mẫu ở 4oC.
Bước 2. Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Chuẩn bị khuôn đổ gel đã cài sẵn răng lược. Hòa tan 0,8 gam agarose trong 100ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng khoảng 2 phút sau đó bỏ ra, lắc đều cho agarose tan rồi tiếp tục đun trong lò vi sóng khoảng 30 giây nữa. Để agarose nguội đến khoảng 60oC thì đổ vào khuôn đổ gel. Đợi khoảng 15 phút cho gel đông thì bỏ răng lược ra. Đặt bản gel trong bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi mức đệm cao hơn mặt gel từ 1 – 2 mm. Trộn 7µl DNA với 4µl dye, tra vào một giếng nhỏ trên gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110 V trong khoảng 30 phút
Bước 3. Nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Lấy bản gel ra khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide. Nhuộm trong 10 phút. Lấy bản gel ra, rửa bằng cách ngâm trong nước 2 – 3 phút. Đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh.
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi nhân bản được đoạn gen rpoC1, bước tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch.
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific gồm các bước sau:
Bước 1. Điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống Eppendorf 1,5ml
Bước 4. Hút dịch sang cột thôi gel, li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.
Bước 5. Bổ sung 700 µl dung dịch rửa vào cột, li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch.
Bước 6. Chuyển cột lọc sang ống Eppendort 1,5 ml, để ở nhiệt độ phòng, mở nắp trong 3 phút cho bay cồn.
Bước 7. Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút ở nhiệt độ phòng, li tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ cột, thu dịch đáy được sản phẩm DNA tinh sạch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.
2.2.2.4. Phương pháp xác đi ̣nh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1
Trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 được xác định bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu. Trình tự gen đó được phân tích, so sánh và lập cây phát sinh chủng loại bằng các chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar.
2.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Sau khi cây dừ cạn được thu về sẽ tiến hành đo các kích thước như: chiều cao của cây, kích thước trung bình của rễ, cuống lá, phiến lá, ống tràng, hoa, quả, đếm số hạt...so sánh giữa các mẫu khác nhau và rút ra nhận xét.
Trình tự nucleotide sau khi được xử lý bằng các phần mềm Bioedit, BLAST, DNAstar, sẽ tiếp tục lập bảng biểu và nhập các số liệu sau đó nhận xét, phân tích và rút ra kết luận.
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016 Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN
3.1.1. Đặc điểm chung về hình thái rễ, thân, hoa, quả và ha ̣t của cây dừa ca ̣n
Hình 3.1. Cây dừa cạn hoa trắng đỏ Hà Giang
Hình 3.1 là hình ảnh cây dừa ca ̣n hoa trắng đỏ thu ta ̣i Hà Giang. Hình thái rễ, thân, hoa, quả và hạt của cây dừa ca ̣n đươ ̣c mô tả ở hình 3.2.
1-Rễ; 2-thân; 3-cách sắp xếp lá; 4-lá; 5-cụm hoa; 6-ống tràng; 7-tiền khai hoa; 8-lá noãn; 9-nhị; 10-hạt phấn; 11-đĩa mật; 12-hoa; 13-quả; 14-hạt.
Rễ cây dừa cạn rất phát triển, rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ, rễ cong queo hoặc thẳng, dài 10 – 20 cm, đường kính 1 - 2 cm, phía trên có đoạn gốc thân dài 3 – 5 cm, phía dưới có nhiều rễ con nhỏ, mặt ngoài hơi nhẵn, có màu nâu vàng, rễ cứng khó bẻ, mặt cắt ngang có màu trắng ngà, không mùi, vị đắng, rễ cái đâm thẳng xuống đất có thể đạt chiều dài 35 - 40 cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa, ngắn, phát triển theo chiều ngang. Thân gỗ ở phía gốc, mặt cắt ngang có hình tròn, mềm ở phần trên, mặt cắt ngang có hình vuông do trên thân non có bốn đường gân chạy dọc thân, các đường gân hơi vặn theo chiều kim đồng hồ, thân nhẵn hoặc có lông ngắn tùy loài, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím hoặc xanh phớt hồng mọc thành bụi dày, thân mềm tẽ nhiều cành nên cây thường nghiêng về một phía. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, dài 3 - 8cm, rộng 1 - 2,5cm, xanh bóng, không lông hoặc có lông ngắn tùy loài, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên, gân lá nhạt màu hơn phiến lá và cuống lá ngắn (dài 1 – 1,8 cm). Cụm hoa, hai hoa ở kẽ lá, hoa đều, lưỡng tính, hoa mẫu 5, cuống hoa dài 4 - 5 mm, hoa có màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu đỏ hơn, mùi thơm, hoa mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4 mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có
5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị 5, rời, dính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi tên, 2 ô, hướng trong, khai dọc, dính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn 2, rời ở bầu nhưng dính ở vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên. Vòi nhụy 1, dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng, đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn. Quả có 2 đại hơi choãi ra, thường tập trung ở phần ngọn, quả dài 2 - 4cm, rộng 2 - 3mm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm [1], [22].
3.1.2. Đặc điểm khá c biê ̣t về hình thái giữa ba giống dừa ca ̣n
Đặc điểm khác biê ̣t giữa ba giống dừa ca ̣n (dừa cạn hoa hồng tím, dừa cạn hoa trắng đỏ, dừa cạn hoa trắng vàng đươ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.3). Kết quả phân tích cho thấy, phần lớn các giống dừa cạn có đặc điểm hình thái tương tự nhau, chỉ khác nhau ở một vài đă ̣c điểm hình thái chi tiết nhỏ. Giống dừa cạn hoa hồng tím và giống hoa trắng đỏ có thân cây và gân lá màu xanh phớt hồng, trong khi giống dừa cạn hoa màu trắng vàng có thân cây và gân lá có màu xanh nhạt. Sự khác biê ̣t rõ nhất thể hiê ̣n ở màu sắc hoa. Giống dừa cạn
hoa hồng tím có cánh hoa màu hồng tím (Hình 3.3A), giống dừa cạn hoa trắng đỏ có cánh hoa màu trắng, phía tâm hoa màu đỏ (Hình 3.3B) và dừa cạn hoa trắng vàng có cánh hoa màu trắng và phía tâm hoa màu vàng (Hình 3.3C).
Hình 3.3. Đặc điểm khác nhau về hình thái giữa ba giống dừa ca ̣n 1A, 2A, 3A, 4A:dừ a ca ̣nhoa hồ ng tím;
3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN
3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn
DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá của cây dừa cạn thu được từ Hà Giang và thái Nguyên bằng CTAB 2%, kết quả kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh.
Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số (1: TIM_HG ; 2: TV_HG; 3: TIM_TN; 4: TRANG_TN )
Hình 3.4 cho thấy kết quả điện di ở cả 4 mẫu lá dừa ca ̣n đều thu đươ ̣c băng DNA, chất lươ ̣ng các mẫu DNA tổng số đều đảm bảo cho phản ứng nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR.
DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá dừa cạn được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r, kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng thang DNA chuẩn 1 kb được thể hiện ở hình 3.5.
500 bp
1000 bp
Hình 3.5.Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen rpoC1
M: thang DNA 1kb; 1- TIM_HG, 2- TV_HG; 3- TIM_TN; 4- TRANG_TN
Hình 3.5 cho thấy sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm đều thu được một băng DNA sáng rõ nét, có kích thước khoảng 500 bp phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gen rpoC1 như dự kiến. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng DNA phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR nhân bản đoạn gen rpoC1 là đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide.
Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen JET PCR Purification của hãng Thermo Scientific sau đó được xác định trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Kết quả xác định trình tự đoạn rpoC1 từ các mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN thu tại Hà Giang và Thái Nguyên được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số
Kết quả so sánh trình tự nucleotid bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.6 cho thấy, gen rpoC1 phân lập từ bốn mẫu TIM_HG, TV_HG, TIM_TN,