Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn

3. Nô ̣i dung nghiên cứu

3.2.1.Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn

DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá của cây dừa cạn thu được từ Hà Giang và thái Nguyên bằng CTAB 2%, kết quả kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh.



Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số (1: TIM_HG ; 2: TV_HG; 3: TIM_TN; 4: TRANG_TN )

Hình 3.4 cho thấy kết quả điện di ở cả 4 mẫu lá dừa ca ̣n đều thu đươ ̣c băng DNA, chất lươ ̣ng các mẫu DNA tổng số đều đảm bảo cho phản ứng nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR.

DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá dừa cạn được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r, kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng thang DNA chuẩn 1 kb được thể hiện ở hình 3.5.



500 bp



1000 bp



Hình 3.5.Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen rpoC1

M: thang DNA 1kb; 1- TIM_HG, 2- TV_HG; 3- TIM_TN; 4- TRANG_TN

Hình 3.5 cho thấy sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm đều thu được một băng DNA sáng rõ nét, có kích thước khoảng 500 bp phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gen rpoC1 như dự kiến. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng DNA phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR nhân bản đoạn gen rpoC1 là đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide.

Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen JET PCR Purification của hãng Thermo Scientific sau đó được xác định trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Kết quả xác định trình tự đoạn rpoC1 từ các mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN thu tại Hà Giang và Thái Nguyên được trình bày ở hình 3.6.

Hình 3.6. Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số

Kết quả so sánh trình tự nucleotid bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.6 cho thấy, gen rpoC1 phân lập từ bốn mẫu TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN đều có kích thước 505 bp. Trong đó, đoạn gen rpoC1 từ mẫu TIM_HG và TIM_TN đều có 139 base loại A, 161 base loại T, 84 base loại C, 121 base loại G. Đoạn gen rpoC1 từ mẫu TV_HG có 139 base loại A, 161 base loại T, 84 base loại C và 121 base loại G. Đoạn gen rpoC1 từ mẫu TRANG_TN có 138 base loại A, 162 base loại T, 84 base loại C và 121 base loại G.

Phân tích bằng BLAST trong NCBI cho kết quả trình tự gen rpoC1

phân lập từ bốn mẫu dừ a ca ̣n hoa hồng tím, hoa trắng vàng và hoa trắng đỏ có đô ̣ tương đồng với trình tự gen rpoC1 mang mã số KC561139 và JN115007 trên Ngân hàng Gen là 99%. Kết quả phân tích bằng BLAST đã khẳng đi ̣nh đoa ̣n gen phân lâ ̣p từ bốn mẫu dừa ca ̣n ở trên là gen rpoC1. Như vậy, chúng tôi đã nhân bản thành công và giải trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ 4 mẫu dừa cạn TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN thu ta ̣i hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên.

Kết quả so sánh trình tự đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ bốn mẫu dừa ca ̣n cho thấy, ba đoạn gen rpoC1 ở các mẫu TIM_HG, TV_HG và KC561139 trên Ngân hàng Gen có độ tương đồng với nhau đạt 100%; tương đồng so với trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 của mẫu dừa cạn TIM_TN là 99,6%, với TRANG_TN là 99,4%. Trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu dừ a ca ̣n TIM_TN và TRANG_TN thu ta ̣i Thái Nguyên tương đồng với nhau là 99,8%.

Tuy nhiên, trình tự nucleotide của gen rpoC1 phân lập từ mẫu TIM_TN có sự sai khác so với trình tự mang mã số KC561139, JK115007 ở hai vị trí nucleotide (495 và 496), gen rpoC1 củ a mẫu TRANG_TN có sự sai khác so với trình tự mang mã số KC561139 ở 3 vị trí nucleotide (494, 495 và 496); trình tự nucleotide củ a gen rpoC1 ở hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN khác nhau ở 1 nucleotide (494), sự sai khác về trình tự nucleotide được tóm tắt ở bảng 3.1.

Sự sai khác về trình tự nucleotid giữa các giống dừa cạn là thông tin rất quan trọng để xây dựng mã vạch DNA cho các giống dừa cạn khác nhau.

Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1

Vi ̣ trí 494 495 496 KC561139 A T G JK115007 A T G TIM_HG A T G TIM_TN A G T TRANG_TN T G T TV_HG A T G

Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự đoa ̣n gen rpoC1 củ a bốn mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN vớ i protein suy diễn từ hai trình tự gen mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng gen quốc tế, kết quả được thể hiê ̣n ở hình 3.7. Kết quả cho thấy gen rpoC1 đều có 168 amino acid. So với protein suy diễn từ trình tự gen

mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng gen với trình tự amino acid suy diễn củ a mẫu TIM_HG và mẫu TV_HG đều có đô ̣ tương đồng 100%; và có độ tương đồ ng với hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN là 99,4%; độ tương đồng giữa hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN là 99,4%.

Tuy nhiên các trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1 biểu hiện sự khác nhau ở mô ̣t amino acid. Trình tự amino acid suy diễn từ gen rpoC1 phân lập từ các mẫu TIM_HG và TV_HG, JN115007 và KC561139 là methionine ở vị trí amino acid thứ 165, còn ở mẫu TIM_TN là serine, ở mẫu TRANG_TN là cysteine (Bảng 3.2).

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của đoa ̣n gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1 Vị trí 165 KC561139 M JN115007 M TIM_HG M TIM_TN S TRANG_TN C TV_HG M

3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC MẪU DỪA CẠN DỰA TRÊN TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN

CỦA ĐOẠN GENrpoC1

Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 mẫu TIM_HG, TV_HG, TIM_TN và TRANG_TN ở Việt Nam với 2 trình tự gen đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai khác của các trình tự đoạn gen rpoC1, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để phân tích sự đa dạng của các mẫu dừa cạn thông qua trình tự đoạn gen rpoC1.

Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn

Hệ số tương đồng H ệ số p h ân ly

Trong các trình tự đoạn gen rpoC1 của dừa cạn được sử dụng để so sánh có 4 mẫu phân lập từ Hà Giang và Thái Nguyên, 2 mẫu từ Ngân hàng gen mang mã số KC561139 và JN115007. Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 99,4% đến 100%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 0,6%.

Mối quan hệ di truyền của 6 mẫu dừa cạn trên cơ sở phân tích gen

rpoC1 được thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.8. Sơ đồ hình cây ở hình 3.8 dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 cho thấy 6 mẫu dừa cạn được phân thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhất gồm 4 mẫu chia thành hai nhánh phụ, nhánh phụ 1 gồm 3 mẫu: TV_HG, TIM_HG, và TIM_TN; nhóm phụ 2 gồm 1 mẫu là TRANG_TN. Nhánh phụ thứ hai lại chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm nhỏ 1 gồm 2 mẫu là TV_HG và TIM_HG; nhóm nhỏ 2 gồm 1 mẫu TIM_TN. Nhóm II gồm 2 mẫu, phân thành 2 nhóm phụ: nhóm phụ là JN115007 và nhóm phụ 2 là KC561139. Khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 5,4%.

TV_HG TIM_HG TIM_TN TRANG_TN JN115007 KC561139 0.0 0.0 0.0 0.0 4.2 2.3 1.2 5.4 0.0 0.0

Hình 3.8. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của 6 mẫu dừa cạn

Như vậy, bốn mẫu dừa cạn mà chúng tôi nghiên cứu thuộc cùng một nhánh chính thứ nhất nhưng ở hai nhánh phụ khác nhau; ba giống TV_HG, TIM_HG và TIM_TN thuộc cùng nhóm, còn giống TRANG_TN thuộc nhóm còn la ̣i.

Tiếp tục phân tích mối quan hệ của bốn mẫu dừa cạn dựa trên trình tự amino acid suy diễn, kết quả thể hiện ở bảng 3.4. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, các mẫu dừa cạn so sánh có hệ số tương đồng về trình tự amino acid suy diễn là rất cao, dao động từ 99,4% đến 100%, hệ số sai khác dao động từ 0,0% đến 0,6%.

Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn củ a gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn

Hệ số tương đồng H ệ số p hâ n ly

Hình 3.9 trình bày mối quan hê ̣ di truyền giữa các mẫu dừa ca ̣n dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1. Khoảng cách di truyền được xác định trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoc1 giữa 6 mẫu dừa cạn là 5,4% (Hình 3.8), còn dựa trên trình tự amino acid suy diễn thì khoảng cách di truyền giữa các mẫu lại rất thấp, chỉ có 0,4% (Hình 3.9).

Hình 3.9. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng dựa trên trình tự amino acid suy diễn của 6 mẫu dừa cạn.

1. Kết luận

1.1. Bố n mẫu dừa cạn thu ở Hà Giang và Thái Nguyên thuộc ba giống dừa cạn hoa hồng tím, hoa trắng vàng và hoa trắng đỏ. Các giống dừa ca ̣n nghiên cứu có thân thảo mọc đứng, rễ chùm, các rễ màu nâu nhạt dần về phía chóp rễ; lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng; hoa lưỡng tính. Ba giống dừa cạn khác nhau về mô ̣t số đă ̣c điểm hình thái và sự khác biê ̣t rõ nhất là màu sắc hoa.

1.2. Đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN thu tại Hà Giang và Thái Nguyên đã được nhân bản và xác định được trình tự nucleotide. Đoa ̣n gen rpoC1 của cả bốn mẫu dừa cạn có kích thước 505 nucleotide, mã hóa 168 amino acid. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 giữa mẫu dừa cạn TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN từ 96,6% đến 100%; còn về trình tự amino acid suy diễn là 99,4% đến 100%.

1.3. Khoảng cách di truyền giữa 4 mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN dựa trên trình tự nucleotide là 5,4%, dựa trên trình tự amino acid suy diễn là 0,4%.

2. Đề nghi ̣

Cần tiếp tục phân tích trình tự nucleotide của các gen phân loại khác nhe gen matK, ITS, … làm cơ sở phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho cây dừa cạn.

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Hoàng Phú Hiê ̣p, Bùi Thị Hà, Trần Đức Cường, Đinh Anh Tuấn,Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mâ ̣u (2016), “Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu dừa cạn (Cantharanthus roseus) dựa trên trình tự gen rpoc1 phân lập từ hệ gen lục lạp”, Bá o cáo khoa học về nghiên cứu và giảng dạy sinh học ở Viê ̣t Nam. Hội nghi ̣ khoa ho ̣c quốc gia lần thứ 2, 5/2016. Nxb Đa ̣i ho ̣c Quốc Gia Hà Nô ̣i, tr 326-331. ISBN: 978-604-62-5440-9.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Viện dược liệu (2001), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr. 57-89.

2. Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận, Vương Chí Hùng, Nguyễn Tiến Hùng (2009), Study on the dynamic variation of 10-DAB and taxol contents of

Taxus wallichiana needles cultivated in Lam Dong province. PHARMA INDOCHINA VI. The development of indochina pharmacy in the context of global economic recession. 15-18/12/2009, tr.621-624.

3. Trần Văn Thanh (2002), Nghiên cứu chiết xuất Ajmalicin từ rễ dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), Luận án tiến sĩ dược học, Đại học dược Hà Nội.

Tiếng Anh

4. Germán S and Pal M. (1998), “RNA Polymerase Subunits Encoded by the Plastid rpo Genes Are Not Shared with the Nucleus-Encoded Plastid Enzyme”. Plant Physiol. 117(4), pp. 1165–1170.

5. Hollingsworth PM, Graham SW, Little DP. (2011), “Choosing and using a plant DNA barcode”, PloS one. 6(5):e19254. doi: 10.1371/journal. pone.0019254.

6. Paul DN Hebert, Alina C, Shelley LB and Jeremy RW (2003). “Biological identifications through DNA barcodes”. Proc. R. Soc. Lond. B (270, pp. 313–321; DOI 10.1098/rspb.2002.2218.

7. Sandelius, Anna Stina, Aronsson, Henrik (2009). The Chloroplast: Interactions with the Environment. Springer. pp. 18. ISBN 978-3-540- 68696-5.

8. Samigullin TK, Martin WF, Troitsky AV, Antonov AS. (1999), “Molecular data from the chloroplast rpoC1 gene suggest a deep and distinct dichotomy of contemporary spermatophytes into two monophyla: gymnosperms (including Gnetales) and angiosperms”. J Mol Evol. 49(3), pp. 310-315.

9. Guggisberg A., Hesse M. (2007), Alkaloids, The University of Zurich. 10. Wouter G van Doorn (2009), Role of chloroplasts and other plastids in

ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva.

Ageing research reviews 9 (2), pp. 117-130. DOI: 10.1016/j.arr. 2009.08.003

11. ParveenI, Singh H.K, Raghuvanshi S and Babbar SB (2013), “Catharanthus roseus voucher SBB-1090 RNA polymerase beta' subunit (rpoC1) gene”, partial cds; chloroplast. GenBank: JN115007.1.

12. Blasko G, Cordell GA (1990) Isolation, structure elucidation, and biosynthesis of the bisindole alkaloids of Catharanthus. In: Brossi A, Suffness M, editors. The alkaloids. San Diego, CA: Academic Press. pp.1– 76.

13. Facchini PJ, De Luca V (2008), “Opium poppy and Madagascar periwincle: model non-model systems to investigate alkaloid biosynthesis in plants”, Plant J. 54, pp. 763–784.

14. Guimaraes G, Cardoso L, Oliveira H, Santos C, Duarte P, et al. (2012), “Cytogenetic characterization and genome size of the medicinal plant

Catharanthus roseus (L.) G. Don”. AoB Plants doi:10.1093/aobpla/ pls002.

15. Kim S, Ban S, Jeong S-C, Chung H-J, Ko S et al. (2007), “Genetic discrimination between Catharanthus roseus cultivars by metabolic fingerprinting using1H NMR spectra of aromatic compounds”,

Biotechnol Bioprocess Eng. 12, pp. 646-652. doi:10.1007/BF02931081. 16. Kim S, Kim J, Liu J (2009), “The Complete Plastid Genome Sequence of

Madagascar Periwinkle Catharanthus roseus (L.) G. Don: Plastid Genome Evolution, Molecular Marker Identification, and Phylogenetic Implications in Asterids”, J Plant Biol 52, pp. 462-465. doi:10.1007 /s12374-009-9059-1.

17. Kool A, de Boer HJ, Krüger Å, Rydberg A, Abbad A, Björk L, et al. (2012), “Molecular Identification of Commercialized Medicinal Plants in Southern Morocco” PLoS ONE 7(6), pp. 39459. doi:10.1371/journal. pone.0039459.

18. Magnotta M, Murata J, Chen JV, De LV (2006), “Identification of a low vindoline accumulating cultivar of Catharanthus roseus (L.) G. Don by alkaloid and enzymatic profiling”. Phytochemistry 67, pp. 1758–1764. 19. Nammi S, Boini MK, Lodagala SD, Behara RB (2003). “The Juice of

fresh leaves of Catharanthus roseus Linn reduces blood glucose in normal and alloxan diabetic rabbits”. BMC Compliment Altern Med. PMID: 12950994; PMCID: PMC194756; DOI: 10.1186/1472-6882-3-4.

20. Rischer H, Oresic M, Seppanen-Laakso T, Katajamaa M, Lammertyn F, et al. (2006), “Gene-to-metabolite networks for terpenoid indole alkaloid

biosynthesis in Catharanthus roseus cells”. Proc Natl Acad Sci USA 103, pp. 5614–5619.

21. Shukla AK, Shasany AK, Gupta MM, Khanuja SPS (2006). “Transcriptome analysis in Catharanthus roseus leaves and roots for comparative terpenoid indole alkaloid profiles”. J Exp Bot. 57, pp. 3921– 3932.

22. Pahwa D. (2008), Catharanthus alkaloids. B. Pharm Punjab University Chandigarh 19(1), pp. 52 – 63.

23. Svoboda GH, Blake DA (1975). The phytochemistry and pharmacology of Catharanthus roseus (L) G. In: Taylor WI, Farnsworth NR, editors. The catharanthus alkaloids. New York, NY: Marcel Dekker, pp. 45–83. 24. Manske RHF (1965), The alkaloid, Chemistry and physiology 8, pp 1-

861. Academic Press New York, London; ISBN: 978-0-12-469517-7. 25. Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A laboratory

Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 26. Sottomayor M, Lopes CI, Pereira LG, Ros BA (2004), “Peroxidase and

the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Phytochem Rev. 3, pp. 159–171. 27. Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994), “The production of imperatorin from Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion