3. Nô ̣i dung nghiên cứu
2.2.2.3.Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ( phương pháp thôi gel)
Sau khi nhân bản được đoạn gen rpoC1, bước tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch.
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific gồm các bước sau:
Bước 1. Điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống Eppendorf 1,5ml
Bước 4. Hút dịch sang cột thôi gel, li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.
Bước 5. Bổ sung 700 µl dung dịch rửa vào cột, li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch.
Bước 6. Chuyển cột lọc sang ống Eppendort 1,5 ml, để ở nhiệt độ phòng, mở nắp trong 3 phút cho bay cồn.
Bước 7. Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút ở nhiệt độ phòng, li tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ cột, thu dịch đáy được sản phẩm DNA tinh sạch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.
2.2.2.4. Phương pháp xác đi ̣nh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1
Trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 được xác định bằng máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu. Trình tự gen đó được phân tích, so sánh và lập cây phát sinh chủng loại bằng các chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar.
2.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Sau khi cây dừ cạn được thu về sẽ tiến hành đo các kích thước như: chiều cao của cây, kích thước trung bình của rễ, cuống lá, phiến lá, ống tràng, hoa, quả, đếm số hạt...so sánh giữa các mẫu khác nhau và rút ra nhận xét.
Trình tự nucleotide sau khi được xử lý bằng các phần mềm Bioedit, BLAST, DNAstar, sẽ tiếp tục lập bảng biểu và nhập các số liệu sau đó nhận xét, phân tích và rút ra kết luận.
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016 Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen và phòng thí nghiệm Thiết bị chung, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN
3.1.1. Đặc điểm chung về hình thái rễ, thân, hoa, quả và ha ̣t của cây dừa ca ̣n
Hình 3.1. Cây dừa cạn hoa trắng đỏ Hà Giang
Hình 3.1 là hình ảnh cây dừa ca ̣n hoa trắng đỏ thu ta ̣i Hà Giang. Hình thái rễ, thân, hoa, quả và hạt của cây dừa ca ̣n đươ ̣c mô tả ở hình 3.2.
1-Rễ; 2-thân; 3-cách sắp xếp lá; 4-lá; 5-cụm hoa; 6-ống tràng; 7-tiền khai hoa; 8-lá noãn; 9-nhị; 10-hạt phấn; 11-đĩa mật; 12-hoa; 13-quả; 14-hạt.
Rễ cây dừa cạn rất phát triển, rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ, rễ cong queo hoặc thẳng, dài 10 – 20 cm, đường kính 1 - 2 cm, phía trên có đoạn gốc thân dài 3 – 5 cm, phía dưới có nhiều rễ con nhỏ, mặt ngoài hơi nhẵn, có màu nâu vàng, rễ cứng khó bẻ, mặt cắt ngang có màu trắng ngà, không mùi, vị đắng, rễ cái đâm thẳng xuống đất có thể đạt chiều dài 35 - 40 cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa, ngắn, phát triển theo chiều ngang. Thân gỗ ở phía gốc, mặt cắt ngang có hình tròn, mềm ở phần trên, mặt cắt ngang có hình vuông do trên thân non có bốn đường gân chạy dọc thân, các đường gân hơi vặn theo chiều kim đồng hồ, thân nhẵn hoặc có lông ngắn tùy loài, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím hoặc xanh phớt hồng mọc thành bụi dày, thân mềm tẽ nhiều cành nên cây thường nghiêng về một phía. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, dài 3 - 8cm, rộng 1 - 2,5cm, xanh bóng, không lông hoặc có lông ngắn tùy loài, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên, gân lá nhạt màu hơn phiến lá và cuống lá ngắn (dài 1 – 1,8 cm). Cụm hoa, hai hoa ở kẽ lá, hoa đều, lưỡng tính, hoa mẫu 5, cuống hoa dài 4 - 5 mm, hoa có màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu đỏ hơn, mùi thơm, hoa mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4 mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có
5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị 5, rời, dính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi tên, 2 ô, hướng trong, khai dọc, dính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn 2, rời ở bầu nhưng dính ở vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên. Vòi nhụy 1, dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng, đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn. Quả có 2 đại hơi choãi ra, thường tập trung ở phần ngọn, quả dài 2 - 4cm, rộng 2 - 3mm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm [1], [22].
3.1.2. Đặc điểm khá c biê ̣t về hình thái giữa ba giống dừa ca ̣n
Đặc điểm khác biê ̣t giữa ba giống dừa ca ̣n (dừa cạn hoa hồng tím, dừa cạn hoa trắng đỏ, dừa cạn hoa trắng vàng đươ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.3). Kết quả phân tích cho thấy, phần lớn các giống dừa cạn có đặc điểm hình thái tương tự nhau, chỉ khác nhau ở một vài đă ̣c điểm hình thái chi tiết nhỏ. Giống dừa cạn hoa hồng tím và giống hoa trắng đỏ có thân cây và gân lá màu xanh phớt hồng, trong khi giống dừa cạn hoa màu trắng vàng có thân cây và gân lá có màu xanh nhạt. Sự khác biê ̣t rõ nhất thể hiê ̣n ở màu sắc hoa. Giống dừa cạn
hoa hồng tím có cánh hoa màu hồng tím (Hình 3.3A), giống dừa cạn hoa trắng đỏ có cánh hoa màu trắng, phía tâm hoa màu đỏ (Hình 3.3B) và dừa cạn hoa trắng vàng có cánh hoa màu trắng và phía tâm hoa màu vàng (Hình 3.3C).
Hình 3.3. Đặc điểm khác nhau về hình thái giữa ba giống dừa ca ̣n 1A, 2A, 3A, 4A:dừ a ca ̣nhoa hồ ng tím;
3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN
3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn
DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá của cây dừa cạn thu được từ Hà Giang và thái Nguyên bằng CTAB 2%, kết quả kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh.
Hình 3.4. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số (1: TIM_HG ; 2: TV_HG; 3: TIM_TN; 4: TRANG_TN )
Hình 3.4 cho thấy kết quả điện di ở cả 4 mẫu lá dừa ca ̣n đều thu đươ ̣c băng DNA, chất lươ ̣ng các mẫu DNA tổng số đều đảm bảo cho phản ứng nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR.
DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá dừa cạn được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r, kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng thang DNA chuẩn 1 kb được thể hiện ở hình 3.5.
500 bp
1000 bp
Hình 3.5.Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen rpoC1
M: thang DNA 1kb; 1- TIM_HG, 2- TV_HG; 3- TIM_TN; 4- TRANG_TN
Hình 3.5 cho thấy sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm đều thu được một băng DNA sáng rõ nét, có kích thước khoảng 500 bp phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gen rpoC1 như dự kiến. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng DNA phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR nhân bản đoạn gen rpoC1 là đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide.
Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen JET PCR Purification của hãng Thermo Scientific sau đó được xác định trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Kết quả xác định trình tự đoạn rpoC1 từ các mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN thu tại Hà Giang và Thái Nguyên được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Trình tự nucleotide củ a đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang mã số
Kết quả so sánh trình tự nucleotid bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.6 cho thấy, gen rpoC1 phân lập từ bốn mẫu TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN đều có kích thước 505 bp. Trong đó, đoạn gen rpoC1 từ mẫu TIM_HG và TIM_TN đều có 139 base loại A, 161 base loại T, 84 base loại C, 121 base loại G. Đoạn gen rpoC1 từ mẫu TV_HG có 139 base loại A, 161 base loại T, 84 base loại C và 121 base loại G. Đoạn gen rpoC1 từ mẫu TRANG_TN có 138 base loại A, 162 base loại T, 84 base loại C và 121 base loại G.
Phân tích bằng BLAST trong NCBI cho kết quả trình tự gen rpoC1
phân lập từ bốn mẫu dừ a ca ̣n hoa hồng tím, hoa trắng vàng và hoa trắng đỏ có đô ̣ tương đồng với trình tự gen rpoC1 mang mã số KC561139 và JN115007 trên Ngân hàng Gen là 99%. Kết quả phân tích bằng BLAST đã khẳng đi ̣nh đoa ̣n gen phân lâ ̣p từ bốn mẫu dừa ca ̣n ở trên là gen rpoC1. Như vậy, chúng tôi đã nhân bản thành công và giải trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ 4 mẫu dừa cạn TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN thu ta ̣i hai tỉnh Hà Giang và Thái Nguyên.
Kết quả so sánh trình tự đoa ̣n gen rpoC1 phân lâ ̣p từ bốn mẫu dừa ca ̣n cho thấy, ba đoạn gen rpoC1 ở các mẫu TIM_HG, TV_HG và KC561139 trên Ngân hàng Gen có độ tương đồng với nhau đạt 100%; tương đồng so với trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 của mẫu dừa cạn TIM_TN là 99,6%, với TRANG_TN là 99,4%. Trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu dừ a ca ̣n TIM_TN và TRANG_TN thu ta ̣i Thái Nguyên tương đồng với nhau là 99,8%.
Tuy nhiên, trình tự nucleotide của gen rpoC1 phân lập từ mẫu TIM_TN có sự sai khác so với trình tự mang mã số KC561139, JK115007 ở hai vị trí nucleotide (495 và 496), gen rpoC1 củ a mẫu TRANG_TN có sự sai khác so với trình tự mang mã số KC561139 ở 3 vị trí nucleotide (494, 495 và 496); trình tự nucleotide củ a gen rpoC1 ở hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN khác nhau ở 1 nucleotide (494), sự sai khác về trình tự nucleotide được tóm tắt ở bảng 3.1.
Sự sai khác về trình tự nucleotid giữa các giống dừa cạn là thông tin rất quan trọng để xây dựng mã vạch DNA cho các giống dừa cạn khác nhau.
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa các trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1
Vi ̣ trí 494 495 496 KC561139 A T G JK115007 A T G TIM_HG A T G TIM_TN A G T TRANG_TN T G T TV_HG A T G
Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự đoa ̣n gen rpoC1 củ a bốn mẫu dừa ca ̣n TIM_HG, TIM_TN, TV_HG, TRANG_TN vớ i protein suy diễn từ hai trình tự gen mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng gen quốc tế, kết quả được thể hiê ̣n ở hình 3.7. Kết quả cho thấy gen rpoC1 đều có 168 amino acid. So với protein suy diễn từ trình tự gen
mang mã số KC561139, JN115007 trên Ngân hàng gen với trình tự amino acid suy diễn củ a mẫu TIM_HG và mẫu TV_HG đều có đô ̣ tương đồng 100%; và có độ tương đồ ng với hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN là 99,4%; độ tương đồng giữa hai mẫu TIM_TN và TRANG_TN là 99,4%.
Tuy nhiên các trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1 biểu hiện sự khác nhau ở mô ̣t amino acid. Trình tự amino acid suy diễn từ gen rpoC1 phân lập từ các mẫu TIM_HG và TV_HG, JN115007 và KC561139 là methionine ở vị trí amino acid thứ 165, còn ở mẫu TIM_TN là serine, ở mẫu TRANG_TN là cysteine (Bảng 3.2).
Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của đoa ̣n gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn TIM_HG, TV_HG, TIM_TN, TRANG_TN và hai trình tự mang
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa các trình tự amino acid suy diễn của gen rpoC1 Vị trí 165 KC561139 M JN115007 M TIM_HG M TIM_TN S TRANG_TN C TV_HG M
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC MẪU DỪA CẠN DỰA TRÊN TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN
CỦA ĐOẠN GENrpoC1
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 mẫu TIM_HG, TV_HG, TIM_TN và TRANG_TN ở Việt Nam với 2 trình tự gen đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai khác của các trình tự đoạn gen rpoC1, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để phân tích sự đa dạng của các mẫu dừa cạn thông qua trình tự đoạn gen rpoC1.
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn
Hệ số tương đồng H ệ số p h ân ly
Trong các trình tự đoạn gen rpoC1 của dừa cạn được sử dụng để so sánh có 4 mẫu phân lập từ Hà Giang và Thái Nguyên, 2 mẫu từ Ngân hàng gen mang mã số KC561139 và JN115007. Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 99,4% đến 100%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 0,6%.
Mối quan hệ di truyền của 6 mẫu dừa cạn trên cơ sở phân tích gen
rpoC1 được thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.8. Sơ đồ hình cây ở hình 3.8 dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 cho thấy 6 mẫu dừa cạn được phân thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhất gồm 4 mẫu chia thành hai nhánh phụ, nhánh phụ 1 gồm 3 mẫu: TV_HG, TIM_HG, và TIM_TN; nhóm phụ 2 gồm 1 mẫu là TRANG_TN. Nhánh phụ thứ hai lại chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm nhỏ 1 gồm 2 mẫu là TV_HG và TIM_HG; nhóm nhỏ 2 gồm 1 mẫu TIM_TN. Nhóm II gồm 2 mẫu, phân thành 2 nhóm phụ: nhóm phụ là JN115007 và nhóm phụ 2 là KC561139. Khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 5,4%.
TV_HG TIM_HG TIM_TN TRANG_TN JN115007 KC561139 0.0 0.0 0.0 0.0 4.2 2.3 1.2 5.4 0.0 0.0
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 của 6