3. Nô ̣i dung nghiên cứu
2.2.2.1.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ lá non của các mẫu giống dừa cạn sử dụng hóa chất CTAB. Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước như sau:
Bước 1. Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (– 1960C) thành bột mịn. Bổ sung vào mẫu 600µl đệm rửa có thành phần (Tris – HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 5mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước). Chia ra 4 ống Eppendorf 1,5ml. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC, bỏ dịch, thu cặn. ( Bước này lặp lại 2 lần).
Bước 2. Thêm vào mỗi ống 500 µl đệm chiết ( bao gồm các thành phần: Tris – HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 20mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; nước), trộn nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65ºC trong vòng 2 giờ (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần). Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Bước 3. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC. Thu dịch pha trên chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
Bước 4. Bổ sung thêm 500µl cloroform : isoamyl alcohol (24 cloroform : 1 isoamyl alcohol) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút. Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC. Hút cẩn thận 500µl dịch trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5µl mới (bỏ tủa). Bước này lặp lại 2 lần. Bước 5. Thêm 500µl isopropanol, trộn nhẹ, tủa DNA ở -20ºC để qua đêm. Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại dịch thu tủa.
Bước 6. Bổ sung 500µl cồn 70 độ. Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần). Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50µl nước cất 2 lần đã khử trùng. Bảo quản ở tủ -200C đến khi sử dụng.