3. Nô ̣i dung nghiên cứu
2.2.2.2.Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR
Bước 1. Nhân gen rpoC1 bằng kỹ thuật PCR
Tham khảo công bố củ a Peter và cs (2011) và bảng các că ̣p mồi DNA Barcoding [37], cặp mồi rpoC1-1F/rpoC1-3R được tổng hợp có trình tự nucleotide như sau:
rpoC1-1f: 5’-GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’ rpoC1-3r: 5’-TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC-3’
Đoạn gen rpoC1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r với kích thước dự kiến là khoảng 508 nucleotide.
Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rpoC1
STT Thành phần Nồng độ Thể tích(l)
1 PCR Masster Mix 2X 7,5
2 Mồi xuôi 10 pmol/l 0,5 3 Mồi ngược 10 pmol/l 0,5
4 DNA khuôn 10ng/μl 0,5
5 Nước khử ion - 6,0
Tổng thể tích 15
Chu trình nhiệt và thời gian hoạt động của máy PCR bao gồm: Biến tính khởi động ở 94oC trong 4 phút; lặp lại 35 chu kì với (biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55oC trong 40 giây, tổng hợp và kéo dài ở 72oC trong 40 giây); ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút và bảo quản mẫu ở 4oC.
Bước 2. Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Chuẩn bị khuôn đổ gel đã cài sẵn răng lược. Hòa tan 0,8 gam agarose trong 100ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng khoảng 2 phút sau đó bỏ ra, lắc đều cho agarose tan rồi tiếp tục đun trong lò vi sóng khoảng 30 giây nữa. Để agarose nguội đến khoảng 60oC thì đổ vào khuôn đổ gel. Đợi khoảng 15 phút cho gel đông thì bỏ răng lược ra. Đặt bản gel trong bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi mức đệm cao hơn mặt gel từ 1 – 2 mm. Trộn 7µl DNA với 4µl dye, tra vào một giếng nhỏ trên gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110 V trong khoảng 30 phút
Bước 3. Nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Lấy bản gel ra khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide. Nhuộm trong 10 phút. Lấy bản gel ra, rửa bằng cách ngâm trong nước 2 – 3 phút. Đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh.