Chủng nấm sợi VN10-1103 đƣợc nuôi cấy trín môi trƣờng tối ƣu thay đổi câc nguồn nitơ khâc nhau bao gồm: peptone, cao men, cazein, (NH4)2SO4, NH4Cl, KNO3, NaNO3 ở nồng độ 1% ở 250C, pH 7, sử dụng chitin 0,6% lăm nguồn cacbon. Sau 6 ngăy thu dịch enzyme thô, xâc định hoạt độ bằng phƣơng phâp định lƣợng chitinase. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 10:
Bảng 10. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy trín
c c nguồn nitơ kh c nhau
STT Nguồn nitơ Hoạt độ chitinase (U/mL)
1 (NH4)2SO4 28,22 ± 0,45 2 NaNO3 14,10 ± 0,29 3 Cao men 106,71 ± 0,09 4 Cazein 38,10 ± 0,17 5 Ure 34,50 ± 0,38 6 Pepton 96,23 ± 0,06
Kết quả ở Bảng 10 cho thấy hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 tăng khi đƣợc nuôi cấy trín môi trƣờng sử dụng nguồn nitơ lă cao men, hoạt độ enzyme đạt 106,71 U/ml. Bín cạnh đó, chủng VN10-1103 cũng sinh tổng hợp chitinase khâ tốt khi nuôi cấy trín môi trƣờng có nguồn nitơ lă pepton (hoạt độ đạt 96,23 U/ml) nhƣng khi nuôi cấy chủng năy trín môi trƣờng với nguồn nitơ lă (NH4)2SO4 vă NaNO3, ure thì hoạt tính chitinase lại giảm đi rõ rệt, hoạt tính lúc năy chỉ đạt 14- 34,5 U/ml. Nhƣ vậy, cao nấm men đƣợc chọn lăm nguồn nitơ cho quâ trình nuôi cấy thu enzyme chitinase.
Kết quả năy hoăn toăn phù hợp với nghiín cứu trƣớc đó về nguồn nitơ thích hợp cho Beauveria bassiana sản sinh chitinase(Priyanka vă cộng sự ,2010) [21]. Đồng thời, cao nấm men cũng đƣợc xâc định lă nguồn nitơ tốt nhất cho một số chủng vi sinh vật khâc sinh tổng hợp chitinase nhƣ: Serratia marcescens [17];
Metarhizium anisopliae [20].
3.5.7. Ảnh hƣởng c a nồng ộ nitơ
Sau khi đƣợc xâc định lă nguồn nitơ tối ƣu cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp chitinase, cao nấm men đƣợc đƣa văo môi trƣờng với câc nồng độ khâc nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2% để khảo sât. Sau 6 ngăy nuôi cấy, thu dịch enzyme vă xâc định hoạt tính chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng. Kết quả đƣợc biểu thị trínHình 14: 0 20 40 60 80 100 120 140 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 U/ml %
Hình 14. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi
cấy trín c c nồng độ cao nấm men kh c nhau
Hình 14cho thấy ở nồng độ nitơ từ 0,8-1,2% thì hoạt độ chitinase khâ cao, đạt từ 99,5-124,5 U/ml, trong đó tại nồng độ nitơ 1,2% thì chủng VN10-1103 có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh nhất (đạt 124,5 U/ml). Trong khi đó, ở nồng độ nitơ thấp hơn so với đối chứng (1%) thì hoạt tính chitinase lại giảm mạnh (chỉ còn từ 20-45 U/ml), giảm gần 60% so với ban đầu. Có thể thấy từ nồng độ cao nấm men 1,2%, tiếp tục tăng nồng độ nitơ trong môi trƣờng thì hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 có xu hƣớng giảm.
3.5.8. Ảnh hƣởng c a thời gian nuôi cấy
Tiến hănh nuôi cấy chủng VN10-1103 với câc điều kiện tối ƣu: môi trƣờng MT2, pH 7, lắc 220 vòng/phút ở 280C, nguồn carbon tối ƣu lă chitin 0,6%, nguồn nitơ tối ƣu lă cao nấm men 1,2% ở câc khoảng thời gian khâc nhau: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ngăy. Thu dịch enzyme vă tiến hănh định lƣợng xâc định hoạt tính chitinase (mục 2.4.4). Kết quả định lƣợng đƣợc thể hiện ở Hình 15.
Hình 15. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 tại c c
thời gian nuôi cấy
Hình 15cho thấy khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 tăng theo thời gian nuôi cấy. Trong khoảng 1-2 ngăy đầu nuôi cấy, lƣợng enzyme
0 20 40 60 80 100 120 140 160 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 U/ml Ngăy
chitinase đƣợc tổng hợp rất ít (hoạt tính chỉ đạt 12-14 U/mL). Đến ngăy nuôi cấy thứ 3, lƣợng enzyme sinh ra trong môi trƣờng nuôi cấy tăng dần vă tăng nhanh cho đến ngăy thứ 7, lúc năy hoạt tính enzyme đạt mức cao nhất (131,82 U/ml), lƣợng enzyme sinh ra giảm nhẹ khi nuôi cấy sang ngăy thứ 8 vă sau đó giảm dần ở câc ngăy tiếp theo.Nhƣ vậy 7 ngăy chính lă thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp enzyme chitinase.
Kết quả năy trùng với thời gian tối ƣu cho Agrobacterium tumefaciens mang gen Bbchit1 của Beauveria bassiana sinh tổng hợp chitinase [52] nhƣng lại khâc với kết quả nghiín cứu của Virgínia Michelle Svedese vă cộng sự trín chủng
Beauveria bassiana (4 ngăy)[58] vă nghiín cứu của Pankaj Patida vă cộng sự (2005) trín đối tƣợng Beauveria felina RD101 (6 ngăy) [50].
3.6. TINH SẠCH SƠ BỘ CHITINASE
Enzyme chitinase VN10-1103 đƣợc tinh sạch qua 2 bƣớc, bƣớc đầu lă cô đặc vă loại bỏ một số hợp chất có trọng lƣợng phđn tử nhỏ hơn 10 kD. Kết quả cho thấy, bằng măng siíu lọc có thể tinh sạch đƣợc một phần chitinase, độ tinh sạch lă 1,07 lần.
Sau đó enzyme năy đƣợc đƣa văo cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephacel. Câc bƣớc tiến hănh đƣợc mô tả phần phƣơng phâp (mục 2.4.8). Kết quả tinh sạch enzyme chitinase VN10-1103 đƣợc thể hiện ởBảng 11, Hình 16 vă Hình 17.
Bảng 11. ết quả tinh sạch chitinase từ B.bassiana VN10-1103
Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg/ml) Hoạt tính enzyme Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) U/ml U/mg Dịch thô 1,94 141,20 72,78 1,0 100 Măng si u lọc 1,54 119,92 77,87 1,07 84,92 DEAE-Sephacel 0,136 55,3 406,62 5,58 39,2
Hình 16. Biểu đồ biểu thị c c phđn đoạn trong tinh sạch chitinase VN10-1103
Kết quả Bảng 11 vă Hình 16cho thấy, enzyme chitinase thô của chủng VN10-1103 khi đi qua cột sắc ký DEAE-Sephacel, cho 4 đỉnh protein ở câc phđn đoạn 6, 11,14. Tuy nhiín, đỉnh hoạt tính lại có 2: phđn đoạn 6 vă 14.
Đỉnh protein ở phđn đoạn 6 đạt 0,136mg/ml, hoạt tính đạt 55,3U/ml. Độ tinh sạch của phđn đoạn năy tăng lín 5,58 lần. Kiểm tra bằng SDS PAGE, phđn đoạn năy gồm một băng duy nhất, kích thƣớc khoảng 45 kDa. Kết quả năy trùng với kích thƣớc của nghiín cứu trƣớc đó của Havukkala vă cộng sự về chitinase do Beauveria
sinh ra [28].
Ở phđn đoạn 14, nồng độ protein đạt 0,049 mg/ml, hoạt tính đạt khoảng 9,59U/ml. Tuy nhiín, do nồng độ protein quâ thấp nín khi điện di trín SDS PAGE, chúng không đƣợc biểu hiện.
Hình17. Sản phẩm điện di SDS-PAGE (A) vă Semi-native PAGE (B) của chitinase
VN10-1103
A: Băng 1: Marker; Băng 2: Dịch chitinase thô; Băng 3: Dịchchitinasetinh sạch
B (Semi-native PAGE): Băng 2: phđn đoạn 6
3.7. NGHIÍN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TINH
SẠCH
3.7.1. pH tối ƣu cho hoạt ộng c a enzyme
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tâc của enzyme, vì nó ảnh hƣởng lớn đến mức độ ion hóa cơ chất vă ảnh hƣởng tới độ bền protein enzyme. Để khảo sât sự ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới hoạt động của chitinase, phản ứng giữa dịch enzyme chitinase tinh sạch vă cơ chất colloidal chitin 0,5% đƣợc thực hiện ở câc pH khâc nhau: 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; ở 370C trong 1h. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 18 (so sânh với đối chứng ở pH 6,0).
Hình 18. Ảnh hưởngcủa pH lín hoạt tính chitinase của B.bassiana VN10-1103
Kết quả ở Hình 18 cho thấy hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 đạt cực đại ở pH 6 vă tƣơng đối cao ở dải pH từ 5-8.
Kết quả năy phù hợp với một số nghiín cứu trƣớc đđy về pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme chitinase của Aspergillus niger [14] vă Vibrio sp. [49].
3.7.2. Nhiệt ộ tối ƣu cho phản ứng enzyme
Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tâc thủy phđn cơ chất của enzyme. Mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Để khảo sât ảnh hƣởng của nhiệt độ tới phản ứng giữa chitinase vă cơ chất, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất colloidal chitin 0,5% ở câc nhiệt độ khâc nhau (mục 2.4.11.1). Hoạt tính đƣợc xâc định bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4). Kết quả đƣợc trình băy ở Hình 19: 0 20 40 60 80 100 120 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH % H oạt t ính tƣơ ng đối
Hình 19. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt động của chitinase từ B.bassiana
VN10-1103
Qua kết quả Hình 19cho thấy hoạt tính enzyme tăng dần ở dải nhiệt độ từ 25- 400C, vă đạt cực đại ở 350C (102,2 % so với đối chứng ở 370C). Sau đấy, khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính enzyme giảm dần, chỉ còn 14,4% ở 800C.
Kết quả năy giống với kết quả nghiín cứu trƣớc đó của Rajasekhar Pinnamaneni vă cộng sự (2010) khi biến nạp gen Bbchit1 của Beauveria bassiana
văo A. tumefaciens [50].
3.7.3. Độ bền nhiệt c a enzyme
Dƣới tâc dụng của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều vă do đó ảnh hƣởng tới hoạt tính. Một số liín kết hydro tham gia văo giữ vững cấu trúc trung tđm hoạt động của enzyme bị đứt gẫy bởi nhiệt độ. Dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở câc nhiệt độ khâc nhau trong 15, 30, 45, 60 phút. Sau đó, tiến hănh xâc định hoạt tính enzyme theo phƣơng phâp định lƣợng. Kết quả đƣợc trình băy tại Hình 20.
0 20 40 60 80 100 120 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 H oạt t ính tƣơ ng đối oC %
Hình 20. Ảnh hưởng của nhiệt độ lín độ bền của enzyme chitinase từ
B.bassiana VN10-1103
Kết quả Hình 20cho thấy ở hầu hết câc nhiệt độ (30-800C) hoạt tính chitinase bền đƣợc trong khoảng thời gian 15-30 phút, sau đấy hoạt tính lần lƣợt giảm mạnh vă sau 60 phút xử lý nhiệt, enzyme hầu nhƣ mất hoạt tính hoăn toăn. Đồng thời qua Hình 20cho thấy chitinase của chủng năy bền ở dải nhiệt độ 30-500C.
Kết quả năy cũng phù hợp với kết quả nghiín cứu của Zhang vă cộng sự (2004) trín chủng Beauveria bassiana Bb174, chitinase của chủng năy khi lín men xốp bền ở nhiệt độ từ 30-400C [30]. Trong khi đó, A.Kapat vă cộng sự (1997) đê xâc định chitinase của nấm Trichoderma harzianum bền nhiệt trong khoảng nhiệt độ 50-600C [32]. Đặc biệt, Meena vă cộng sự (2014) đê nghiín cứu độ bền nhiệt của chitinase từ chủng Brevibacillus formosus BISR-1 có thể lín tới 1000C [45].
3.7.4. Độ bền pH c a enzyme
pH ảnh hƣởng đến độ bền của enzyme, do vậy việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme lă rất quan trọng. Tùy loại enzyme mă có độ bền trong những pH nhất định. Ở đđy độ bền pH của chitinase từ B. bassiana VN10-1103 đƣợc xâc định bằng câch ủ enzyme trong đệm có câc pH khâc nhau (pH 3-9) trong 15, 30, 45 vă 60 phút. Hoạt tính enzyme sau khi ủ đƣợc xâc định bằng phƣơng phâp định lƣợng,
0 20 40 60 80 100 120 0 15 30 45 60 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC 80oC Hoạ t tí nh tƣơng đối % phút
đối chứng lă mẫu enzyme chitinase không xử lý pH. Kết quả đƣợc trình băy ở Hình 21.
Hình 21. Ảnh hưởng của pH lín độ bền chitinase của B. bassiana VN10-
1103
Kết quả thu đƣợc cho thấy rằng chitinase của B.basiana kĩm bền nhất ở pH 3 (hoạt tính giảm chỉ còn 40,58%), bền ở dải pH từ 6-8 trong đó tại pH 6 enzyme đạt độ bền lớn nhất, khi pH căng tăng thì độ bền enzyme căng giảm. Enzyme chitinase của VN10-1103 khi xử lý pH có thể bền trong khoảng thời gian lă 15-45 phút.
Kết quả năy phù hợp với nghiín cứu của Wang cùng cộng sự (1997) trín đối tƣợng Pseudomonas aeruginosa, chitinase của chủng năy bền ở dải pH từ pH 6- 8[62]. Zeki vă cộng sự (2010) xâc định chitinase từ chủng Serratia marcescens bền trong dải pH từ 5-7 [65].
3.7.5. Ảnh hƣởng c a câc ion kim loại
Để xâc định ảnh hƣởng của câc ion kim loại lín hoạt tính chitinase, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất colloidal chitin 0,5% vă dung dịch câc ion kim loại Na+
, K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+ vă EDTA ở nồng độ 5 mM ở 370C trong 1h. Xâc định hoạt độ enzyme bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục
0 20 40 60 80 100 120 0 15 30 45 60 pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 Hoạ t tí nh tƣơng đối % phút
Hình 22. Ảnh hưởng của c c ion kim loại lín hoạt tính chitinase của chủng VN10-
1103
Hình 22cho thấy câc ion kim loại vă EDTA ở nồng độ 5 mM có ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme so với đối chứng (ĐC). Trong đó, câc ion kim loại nhƣ Fe3+, Cu2+ vă EDTA ức chế hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 trong khi hầu hết câc ion kim loại còn lại hầu nhƣ ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính chitinase của chủng năy (Mg2+, Zn2+, Fe2+). Ion Ca2+, K+, Na+, có tâc dụng tăng cƣờng hoạt tính chitinase, đặc biệt lă ion Ca2+ lăm tăng khả năng xúc tâc của enzyme lín tới 1,5 lần. Kết quả năy phù hợp với một số nghiín cứu trƣớc đđy trín thế giới về ảnh hƣởng của ion kim loại tới khả năng xúc tâc của chitinase. Theo N. Annamalai vă công sự (2010) khi nghiín cứu đặc tính chitinase từ chủng Micrococcus sp. AG84 cho thấy, câc ion Fe2+, Mn2+, Ca2+ vă Ni2+ ở nồng độ 5mM có khả năng tăng cƣờng hoạt tính chitinase trong khi EDTA, Hg2+
, Co2+, Cu2+ ức chế hoạt động enzyme[8]. Mathivanan vă cộng sự (1998) trín đối tƣợng Fusarium chlamydosporum[43]cũng cho thấy khả năng xúc tâc của chitinase bị ức chế dƣới tâc động của câc ion Fe3+ vă Cu2+. Tsujibo (1992) nghiín cứu trín đối tƣợng Alteromonas sp. O-7 cũng cho kết quả tƣơng tự, câc ion Ca2+ vă Na+ có khả năng tăng cƣờng hoạt động của enzymechitinase[49]. 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Cu2+ K+ Ca2+ Mg2+ Zn2+ Na+ Fe2+ EDTA Fe3+ ĐC
H oạt t ính tƣơ ng đối %
3.7.6. Khả năng phđn giải cơ chất c a enzyme
Để xâc định khả năng phđn cắt của chitinase lín cơ chất, tiến hănh ủ enzyme chitinase tinh sạch của chủng VN10-1103 với hexose của N-acetyl glucosamine trong 4h-6h trong đệm citrat photphat 0,1M pH 6,0 ở 370C, hỗn hợp đƣờng thu đƣợc sau phản ứng đƣợc phđn tích bằng phƣơng phâp chạy sắc ký bản mỏng TLC. Kết quả thu đƣợc thể hiện trín Hình 23.
Hình 23. hả n ng phđn cắt c c cơ chất kh c nhau của chitinase sinh tổng
hợp bởi chủng VN10-1103
G1: N- acetyl glucosamine; G2: diacetylchitobiose; G3: chitotriose; G4: chitotetraose; G5: chitopentaose; G6: chitohexaose
Kết quả phđn tích TLC cho thấy sau 4h, chitinase tinh sạch phđn giải hexose thănh G4 vă G2; tuy nhiín sau 6h sản phẩm phđn giải thu đƣợc chủ yếu lă G2.
3.7.7. Khả năng khâng vi sinh vật c a chế phẩm
Chế phẩm đƣợc tạo ra sau khi ủ colloidal chitin vă chitinase của chủng VN10-1103 ở câc điều kiện tối ƣu (đệm citrat photphat pH 6, nhiệt độ 350C), tiến hănh đânh giâ khả năng khâng nấm Fusarium oxysporum vă vi khuẩn
Shigellaflexnericủa chế phẩm ở câc độ pha loêng 10, 20, 30, 40 vă 50 lần (mục 2.4.6). Kết quả đƣợc trình băy trongHình 24:
A B
Hình 24. hả n ng kh ng Fusarium oxysporum (A) vă Shigella flexneri (B) của chế
phẩm của chủng VN10-1103
Dựa trín kết quả Hình 24có thể thấy chế phẩm sau khi ủvới enzyme chitinase tinh sạch của chủng VN10-1103 ở câc nồng độ khâc nhau đều có khả năng khâng
Fusariumoxysporumvă Shigella flexneri. Khi nồng độ pha loêng lín tới 30 lần, chế phẩm vẫn có thể khâng nhƣng khả năng khâng giảm đi nhiều. Ở nồng độ pha loêng 50 lần, chế phẩm không còn khả năng khâng trín cả 2 loăi Fusarium oxysporum vă
KẾT LUẬN VĂ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đê săng lọc đƣợc 44 chủng có hoạt tính chitinase cao bằng phƣơng phâp đặt thạch từ 438 chủng nấm sợi
2. Đê tiến hănh đânh giâ hoạt tính chitinase của 44 chủng nấm sợi bằng phƣơng phâp định tính chọn đƣợc 10 chủng nấm có hoạt tính chitinase cao, vă tiếp tục đânh giâ 10 chủng năy bằng phƣơng phâp định lƣợng, chọn đƣợc chủng VN10- 1103 lă chủng có hoạt tính chitinase cao nhất cho câc nghiín cứu tiếp theo.
3. Đê xâc định chủng VN10-1103 thuộc loăi Beauveria bassiana bằng phƣơng phâp phđn loại bằng hình thâi vă phđn tích trình tự gen ADNr 28S.
4. Đê nghiín cứu điều kiện thích hợp cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp enzyme chitinase cao nhất (131,82 U/mL): nuôi cấy trín MT2, 28°C, pH 7 sau 7 ngăy nuôi cấy, nguồn carbon vă nitơ thích hợp lần lƣợt lă colloidal chitin ở nồng độ 0,6% vă cao nấm men 1,2%.
5. Đê tinh sạch sơ bộ enzyme chitinase của VN10-1103: trọng lƣợng phđn tử lă 45kDa; độ tinh sạch 5,58 lần.
6. Đê xâc định đƣợc một số yếu tố liín quan đến hoạt tính enzyme chitinase của chủng VN10-1103: hoạt động tối ƣu ở pH 6, 350C; bền trong khoảng pH từ pH 6-8; ở dải nhiệt độ 30-500C; bị ức chế hoạt động bởi câc ion Fe3+, Cu2+, EDTA vă đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+
, K+, Na+; có khả năng phđn giải cơ chất hexose của N- acetyl glucosamine thănh câc chitotetraose vă diacetylchitobiose; chế phẩm