lấy dịch); Đƣờng kính: 20; Thạch: 15, Pepton: 5
2.3.2. Môi trƣờng LCA (Low Carbon Agar) ể phđn loại hình thâi học (g/l)
Glucose: 1,0; KH2PO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,2; KCl: 0,2; NaNO3:2,0; Cao nấm men: 0,2; Agar: 15.
2.3.3. Môi trƣờng LB (Luria-Bertani)-agar (g/l)
Trypton wasser có sẵn muối: 15g; Cao nấm men: 5g; Thạch: 20g
2.3.4. Môi trƣờng l n men dịch thể (g/l) nghi n cứu chitinase
Thănh phần môi trƣờng Kí hiệu
0,2% chitin + basal salt mediuma MT1
0,2% chitin + 1% cao nấm men + 1% peptone + 2% dextrose
MT2
0,2% chitin + 2% dextrose MT3
0,2% chitin + 1% cao nấm men MT4
0,2% chitin +1% peptone + 2% dextrose MT5
0,2% chitin +1% cao nấm men +2% dextrose MT6
a:Basal salt medium bao gồm: 0,2% NaNO3 , 0,1% KH2PO4, 0.05% MgSO4.7H2O, 0.05% KCl, 0,001% FeSO4·7H2O, 0,3% sucrose.
2.3.5. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme chitinase tr n ĩa thạch
0,1% cơ chất chitin vă 2% thạch
2.4. PHƢƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU
2.4.1. Phƣơng phâp săng lọc sơ bộ hoạt tính chitinase c a câc ch ng nấm sợi
PDA thạch) để trong tủ ấm 280
C, 5-7 ngăy.
+Dùng ống nhựa vô trùng đƣờng kính 5mm cắt phần thạch có nấm sợi mọc tốt, chuyển miếng thạch sang môi trƣờng thử hoạt tính phđn giải chitin (mục2.3.5), đặt ở tủ ấm 280
C, 72h.
+ Nhuộm bằng dung dịch đỏ congo (0,1%) trong 2h, sau đó rửa bằng dung dịch NaCl 1M, chủng nấm sợi sinh chitinase phđn hủy chitin, tạo vòng sâng quanh khuẩn lạc, đo kích thƣớc vòng phđn giải, so sânh khả năng phđn giải của câc chủng dựa văo kích thƣớc vòng phđn giải.
+ Chọn câc chủng có hoạt tính phđn giải cơ chất chitin cao nhất.
2.4.2. Phƣơng phâp nuôi cấy nấm sợi sinh tổng hợp chitinase
Câc chủng nấm đƣợc nuôi cấy trín 25ml môi trƣờng dịch thể trong bình tam giâc 100ml. Mỗi bình đƣợc thím văo 1ml dung dịch băo tử nấm (106
băo tử/ml), nuôi cấy ở 280C, 200 vòng/ phút. Sau 6 ngăy nuôi cấy thu dịch enzyme bằng câch ly tđm 10000 vòng/phút ở 40C, 15 phút. Thu dịch nổi để nghiín cứu.
2.4.3. Phƣơng phâp ịnh tính enzyme chitinase
+ Chuẩn bị môi trƣờng thạch có chứa 0,1% cơ chất (chitin) vă 2% thạch. Khử trùng (121oC/20 phút), thực hiện thao tâc trong phòng cấy vô trùng, đổ 25ml môi trƣờng ra đĩa petri đê khử trùng, để đông thạch.
+ Dùng ống nhựa vô trùng đƣờng kính 5 mm tạo thănh giếng trín môi trƣờng chứa cơ chất. (Mỗi đĩa thạch tạo 5 giếng/ đĩa: 4 giếng thử hoạt tính, 1 giếng lăm đối chứng đm lă môi trƣờng nuôi cấy).
+ Cho 50μl dịch enzyme văo câc giếng thạch.
+ Để trong tủ lạnh 40C trong 30 phút, sau đó để tủ ấm 370
trong 24h.
+ Nhỏ 10 ml đỏ congo 0,1% nhuộm trong 2h sau đó rửa sạch bằng dung dịch NaCl 1M, đânh giâ hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp đo vòng phđn giải (D- d;mm),trong đó:
D: đƣờng kính vòng phđn giải d: đƣờng kính lỗ thạch.
2.4.4. Phƣơng phâp ịnh lƣợng chitinase[58]
Chuẩn bị hoâ chất
Dung dịch DNS(dinitrosalicylic acid)
- Dung dịch A: cho 880 ml dung dịch DNS 1% vă 255g muối Rochelle văo 300 ml dung dịch NaOH 4,5%.
- Dung dịch B: Cho 10g tinh thể phenol văo 22 ml NaOH 10%. Sau đó thím nƣớc để đạt thể tích 100 ml.
Hoă tan 6,9 g NaHCO3 trong 69 ml dung dịch B, rồi trộn lẫn với dung dich A, để dung dịch trín trong tối 2 ngăy trong một bình sẫm mău trƣớc khi sử dụng (Dung dịch năy có thể sử dụng trong vòng 2 thâng).
Colloidal chitin:
Cho 10g chitin văo 60 ml dung dịch HCl 10N, khuấy đều bằng mây khuấy từ ở tốc độ chậm qua đím tại 40
C.
Bổ sung 500 ml ethanol lạnh, khuấy nhẹ bằng mây khuấy từ qua đím ở 40C. Sau đó ly tđm 10000 vòng/phút để thu kết tủa dạng keo. Rửa kết tủa dạng keo thu đƣợc bằng nƣớc cất nhiều lần cho đến khi pH đạt 7,0.
Lăm khô kết tủa keo nói trín ở nhiệt độ 800C. Giữ tại 40C cho đến khi sử dụng.
Dung dịch cơ chất:
• 50 mg colloidal chitin trong 10 ml đệm citrate photphat 0,1M pH 6,0. • Ủ hỗn hợp trín ở nhiệt độ 370
C trong vòng 30 phút.
Lấy 2 mg/ml N-acetyl glucosamine cho văo ống falcol vô trùng, lắc đều dung dịch đƣờng. Pha loêng dung dịch N-acetyl glucosamine chuẩn thănh 6 dung dịch có nồng độ khâc nhau nhƣ sau:
Bảng 2.Nồng độ pha loêng N-acetyl glucosamin (mg/ml)
Nồng độ pha loêng
(mg/ml) 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
N-acetyl glucosamin
(ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Nƣớc (ml) 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0
- Lắc đều dung dịch pha loêng
- Cho 0,2 ml dung dịch ở mỗi ống nghiệm trín sang câc ống mới - Thím 0,6 ml dung dịch DNS văo ống nghiệm trín, lắc đều - Giữ nhiệt độ sôi trong 5 phút
- Lăm lạnh nhanh trong dung dịch nƣớc đâ - Pha loêng với 4,2 ml nƣớc cất
- Đo sự hấp thụ ở bƣớc sóng 500nm - Lặp lại thí nghiệm 2 lần
- Dựng đƣờng chuẩn với câc giâ trị đo OD trung bình
Bảng 3. ết quả đo độ hấp thụ của đường N-acetyl glucosamin ở bước sóng 500nm
Nồng độ pha loêng (mg/ml) Giâ trị OD (Bƣớc sóng 500 nm) Lần 1 Lần 2 Trung bình 0,2 0,086 0,07 0,078 0,4 0,221 0,218 0,2195 0,8 0,587 0,545 0,5395
1,2 0,857 0,861 0,859 1,6 1,184 1,202 1,193 2 1,551 1,538 1,5445 Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: Y = 0,8147X – 0,1029 R2 = 0,9993
X: Hăm lƣợng đƣờng N- acetyl glucosamine có trong dung dịch Y: Giâ trị đo OD ở bƣớc sóng 500nm.
Hình 4. Đồ thị chuẩn biểu diễn độ hấp thụ của N-acetyl glucosaminở bước
sóng 500nm
Câch tiến hănh phản ứng
Thực hiện phản ứng trong ống eppendorf
• Nhỏ 500 μl dịch enzyme vă 500 µl cơ chất (vừa chuẩn bị) văo ống eppendorf (1,5 ml), giữ 60 phút trong bể ổn nhiệt 37°C.
• Đun sôi 5 phút để dừng phản ứng, sau đó ly tđm 10000 vòng/phút trong 10
Đƣờng chuẩn N-acetyl glucosamine y = 0.8147x - 0.1029
R2 = 0.9993 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 0.5 1 1.5 2 2.5 mg/ml OD 500nm
phút. Hút lấy 200 µl dịch trong.
• Bổ sung 600 μl dung dịch DNS, đun sôi 5 phút vă lăm lạnh nhanh trong nƣớc đâ. Bổ sung 4,2ml nƣớc cất, đảo đều.
• Đo độ hấp phụ ở bƣớc sóng 500 nm.
• Đối chứng đm: bổ sung dung dịch DNS văo dịch enzyme đê bất hoạt (đun sôi 10 phút), sau đó thím cơ chất.
Một đơn vị enzyme (U/ml) chính lă lƣợng enzyme thủy phđn tạo ra 100μg đƣờng trong phản ứng.
Hăm lƣợng enzyme (đơn vị) X (μg) x 5 (tổng hăm lƣợng đƣờng phđn giải trong 1 ml) x 2 (tổng hăm lƣợng enzyme trong 1 ml) / 100 X (μg) /10
Ghi chú:
X (μg): hăm lƣợng đƣờng thu đƣợc (dựa văo đƣờng chuẩn)
2.4.5. Phƣơng phâp sắc ký bản mỏng (TLC- Thin layer chromatography) chromatography)
- Nguyín liệu:
+ Bản gel silica TLC 60 F254 (Merk)
+ Dung môi: n-butanol : axit axetic : H2O theo tỷ lệ 2:1:1 + Dung dịch phât hiện phản ứng:
Dung dịch 1: Hòa tan 1g diphenylamine trong 20 ml axeton vă cho thím axeton cho đủ 25 ml
Dung dịch 2: thím 1 ml aniline văo 24 ml axeton vă khuấy đều.
Dung dịch 3: 5 ml axit phosphoric 85%
Trộn đều 3 dung dịch ngay trƣớc khi sử dụng
+ Chất chuẩn: Mono-, di-, tri-, penta-, vă hexamer của chitin (Sigma), hòa tan trong nƣớc khử trùng với nồng độ 1 mg/ml.
- Phƣơng phâp thực hiện:
đậy buồng năy lại vă để dung dịch bốc hơi bêo hòa buồng chạy.
+ Chấm mẫu lín bản chạy sắc ký (câch đây bản chạy năy tối thiểu 1 cm). Lƣợng mẫu chạy có thể lă 5 ml/mẫu vă chấm lặp đi lặp lại nhiều lần (lƣu ý sấy khô điểm chấm mẫu sau mỗi lần chấm). Đối với chất chuẩn, thƣờng sử dụng 1-2 µl (1 µg/µl) lă phù hợp.
+ Sau khi chấm mẫu, đặt bản chạy sắc ký văo buồng chạy vă chạy cho đến khi mặt trín của dung môi chạy câch đỉnh của bản sắc ký 1 cm.
+ Lấy bản sắc ký ra, sấy khô vă xịt dung dịch nhận biết
+ Tiếp tục sấy khô bản mỏng năy vă sau đó để ở 1000C trong 10 phút. Phản ứng cho kết quả lă câc điểm mău đỏ hoặc hồng.
+ So sânh câc điểm ở mẫu vă ở chất chuẩn để đọc kết quả.
2.4.6. Phƣơng phâp xâc ịnh khả năng khâng vi sinh vật
+ Chuẩn bị môi trƣờng LB-agar (mục 2.3.3) cho vi khuẩn vă môi trƣờng PDA (mục 2.3.1) cho câc chủng nấm sinh trƣởng.
+ Hút 100 µl dịch nuôi mỗi loại vi sinh vật kiểm định sau đó trải lín đĩa petri + Dùng ống hút vô trùng đƣờng kính 5 mm đục câc lỗ trín đĩa thạch vừa đƣợc cấy trải vi sinh vật kiểm định.
+ Nhỏ 50 µl dung dịch cần kiểm tra tính khâng vi sinh vật lín mỗi giếng. Đối chứng dƣơng: nhỏ 50 µl nƣớc cất văo mỗi giếng.
+ Đặt đĩa thạch văo tủ 280C đối với nấm vă 370C đối với vi khuẩn trong 3 ngăy vă đọc kết quả
+ Khả năng khâng vi sinh vật kiểm định thể hiện ở câc vòng sâng không có vi sinh vật mọc xung quanh mỗi giếng.
2.4.7. Nghi n cứu câc iều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chitinase c a nấm sợi
2.4.7.1. a ch n i tr ng nuôi cấy th ch h p
+ Chủng nấm sợi lựa chọn đƣợc nuôi cấy trín 6 môi trƣờng khâc nhau ở 280C, lắc 220 vòng/phút. Sau 6 ngăy nuôi cấy, lấy dịch nuôi cấy vă ly tđm lạnh 40C,
10000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch enzyme thô.
+ Hoạt độ chitinase đƣợc xâc định bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.7.2. a ch n nhiệt ộ nu i cấy th ch h p
+ Chủng nấm sợi nghiín cứu đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng phâp lín men ở môi trƣờng thích hợp nhất (mục2.4.7.1) ở câc dải nhiệt độ khâc nhau: 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 500C. Sau 6 ngăy nuôi cấy, thu dịch nuôi, ly tđm lạnh 40C, 10000 vòng/ phút trong 15 phút, xâc định hoạt độ bằng phƣơng phâp định lƣợng chitinase (mục 2.4.4)
2.4.7.3. a ch n pH i tr ng th ch h p
+ Nuôi cấy chủng nấm sợi đƣợc lựa chọn trín môi trƣờng vă nhiệt độ thích hợp nhất (mục 2.4.7.1 vă2.4.7.2), điều chỉnh ở câc pH khâc nhau 3; 3,5; 4; 4,5; 5, 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9. Sau 6 ngăy nuôi cấy, thu dịch nuôi, ly tđm 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C, thu dịch enzyme thô.
+ Xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4)
2.4.7.4. a ch n ngu n carbon
+ Chủng nấm sợi đƣợc lín men trín môi trƣờng tối ƣu (mục 2.4.7.1) thay câc nguồn carbon khâc nhau bao gồm: chitin, CMC, colloidal chitin, chitosan, N- acetyl glucosamine, sucrose, glucose, fructose, tinh bột tan nồng độ 1% ở nhiệt độ, pH thích hợp (mục2.4.7.2;2.4.7.3). Thu dịch thô, xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
+ Để tối ƣu nồng độ carbon, chủng nấm sợi đƣợc nuôi trín môi trƣờng với nguồn carbon tối ƣu với câc nồng độ khâc nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2 %. Sau 6 ngăy nuôi cấy, thu dịch nuôi, ly tđm, 10000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C, thu dịch enzyme thô vă tiến hănh xâc định hoạt độ bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.7.5. a ch n ngu n nitơ
+ Chủng nấm sợi đƣợc lín men trín môi trƣờng tối ƣu (mục2.4.7.1), thay đổi câc nguồn nitơ khâc nhau bao gồm: peptone, cao men, cazein, (NH4)2SO4, NH4Cl, KNO3, NaNO3nồng độ 1% ở nhiệt độ, pH, nguồn cacbon thích hợp (mục2.4.7.2; 2.4.7.3vă2.4.7.4). Thu dịch enzyme thô, xâc định hoạt độ bằng phƣơng phâp định lƣợng chitinase (mục 2.4.4).
+ Sau khi chọn đƣợc nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase, tiến hănh xâc định nồng độ nitơ tối ƣu bằng câch nuôi chủng nấm sợi ở câc nồng độ nitơ khâc nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2% trong 6 ngăy, thu dịch enzyme vă xâc định hoạt tính bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.7.6. a ch n th i gian nuôi cấy th ch h p
+ Chủng nấm sợi đƣợc nuôi cấy trín môi trƣờng, nhiệt độ, pH, nguồn cacbon vă nguồn nitơ thích hợp nhất (mục2.4.7.1; mục2.4.7.2; mục 2.4.7.3; mục 2.4.7.4 vă2.4.7.5). Dịch enzyme thô đƣợc thu sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ngăy nuôi cấy.
+ Xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4)
2.4.8. Tinh sạch sơ bộ enzyme chitinase
Dịch enzyme thô ↓ Ly tđm 10 phút ở 12000 vòng/phút, 40C ↓ Dịch trong ↓
Cô đặc enzyme qua măng lọc cellulose ↓
Qua cột Ion Exchange ↓
Hình 5. Quy trình tinh sạch enzyme chitinase sinh tổng hợp bởi chủng nấm sợi lựa
chọn
Năm mƣơiml dịch enzyme sau khi ly tđm 10 phút, 12000 vòng/phút, ở40C đƣợc cho văo măng cellulose kích thƣớc 10 kDa, ly tđm lạnh 40
C, tốc độ 8000 vòng/phút cho đến khi thu đƣợc một lƣợng dịch enzyme không đổi. Dịch enzyme sau khi đƣợc cô đặc bởi măng lọc đƣa qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephacel. Cột có kích thƣớc 20 x 2,5 cm đƣợc cđn bằng với đệm Tris-HCl 20mM pH 7,5. Sau đó tiến hănh rửa cột với thể tích đệm Tris-HCl gấp 3 lần thể tích cột. Tiếp theo cột đƣợc tâch rửa bởi muối NaCl có gradient nồng độ từ 0-1M. Tốc độ chảy lă 25 ml/h. Thể tích mỗi phđn đoạn thu đƣợc lă 5 ml (thu 20 phđn đoạn). Hăm lƣợng protein vă số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xâc định trong mỗi phđn đoạn.
2.4.9. Điện di SDS-PAGE
Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tâch chiết vă độ tinh sạch của enzyme đƣợc đânh giâ bằng phƣơng phâp điện di trín gel polyacrylamide.
Chuẩn bị mẫu: 8 µl loading buffer (0,2M Tris/HCl pH 6,8 có chứa 2% SDS, 20% glycerol vă 0,002% bromophenol vă 5% β- mercaptoethanol) đƣợc thím văo 16 µl enzyme trong eppendorf 1,5 ml (tỷ lệ 1:2) sau đó đun sôi 3 phút vă ly tđm.
Bảng 4. Thănh phần bản gel SDS-PAGE (12,5% polyacrylamid)
Thănh phần Running gel (µl) Stacking gel (µl)
Acrylamid 30% 2100 220 Tris HCl 1.5M pH 8,8 1250 0 Tris HCl 1.5M pH 6,8 0 415 SDS 10% 50 16,5 Nƣớc MQ 1600 1015 APS 25 8,35
TEMED 2 0,85 Tra mẫu văo câc giếng chạy điện di.
Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 40 mA, 110V
Bản gel sau khi chạy đƣợc nhuộm với Comassine Briliant Blue (CBB) G250 0,06% (0,6 g Comassine Blue G250; 100ml CH3COOH; nƣớc vừa đủ 1000 ml) trong 30 phút rồi tiến hănh rửa gel bằng dung dịch rửa (70 ml axit axetic; 50 ml methanol; nƣớc vừa đủ 1 lít) cho đến khi thấy câc băng rõ răng.
2.4.10.Xâc ịnh hoạt tính chitinase trín Semi-Native PAGE
Bảng 5. Thănh phần bản gel semi- native PAGE (12,5% polyacrylamide)
Thănh phần Running gel (µl) Stacking gel (µl)
Acrylamide 30% 2100 220 Tris HCl 1,5M pH 8.8 1250 0 Tris HCl 1.5M pH 6.8 0 415 SDS 10% 50 16,5 Nƣớc khử ion 1100 1015 Glycochitin 0.5% 500 0 APS 10% 25 8,35 TEMED 2 0,85
- 10µl mẫu + 10µl loading buffer (0,2M Tris/HCl pH 6,8 có chứa 2% SDS, 20% glycerol vă 0,002% bromophenol)
- Chạy điện di 150V, 40mA
- Sau khi điện di ủ gel trong 20mM Tris/HCl pH 6,8 có chứa 1% Triton X- 100 trong 1h
- Nhuộm với 0,01% Calcoflour 5-10 phút - Rửa sạch với nƣớc ít nhất 1-2h
- Soi dƣới tia UV
2.4.11.Xâc ịnh một số ặc tính c a enzyme chitinase tinh sạch
2.4.11.1. Xâc ịnh nhiệt ộ tối u vă pH tối u
+ Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đê tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% colloidal chitin trong đệm citrate photphat 0,1M pH 6,0; ủ hỗn hợp phản ứng ở câc nhiệt độ khâc nhau từ 20-800C trong 1h. Xâc định hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục2.4.4). Đối chứng lă mẫu enzyme phản ứng ở 370
C. + Để xâc định pH tối ƣu, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% colloidal chitin ở câc pH khâc nhau (colloidal chitin đƣợc ủ ở câc đệm có pH khâc nhau từ pH 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9) ở 370C trong 1h. Xâc định hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.11.2. Xâc ịnh ộ bền nhiệt vă ộ bền pH của enzyme chitinase
+ Để xâc định độ bền nhiệt của chitinase, tiến hănh xử lý enzyme ở câc nhiệt độ khâc nhau: 30, 40, 50, 60, 70, 800C trong 15, 30, 45, 60 phút. Xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4). Đối chứng lă mẫu enzyme không qua xử lý nhiệt.