Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tâch chiết vă độ tinh sạch của enzyme đƣợc đânh giâ bằng phƣơng phâp điện di trín gel polyacrylamide.
Chuẩn bị mẫu: 8 µl loading buffer (0,2M Tris/HCl pH 6,8 có chứa 2% SDS, 20% glycerol vă 0,002% bromophenol vă 5% β- mercaptoethanol) đƣợc thím văo 16 µl enzyme trong eppendorf 1,5 ml (tỷ lệ 1:2) sau đó đun sôi 3 phút vă ly tđm.
Bảng 4. Thănh phần bản gel SDS-PAGE (12,5% polyacrylamid)
Thănh phần Running gel (µl) Stacking gel (µl)
Acrylamid 30% 2100 220 Tris HCl 1.5M pH 8,8 1250 0 Tris HCl 1.5M pH 6,8 0 415 SDS 10% 50 16,5 Nƣớc MQ 1600 1015 APS 25 8,35
TEMED 2 0,85 Tra mẫu văo câc giếng chạy điện di.
Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 40 mA, 110V
Bản gel sau khi chạy đƣợc nhuộm với Comassine Briliant Blue (CBB) G250 0,06% (0,6 g Comassine Blue G250; 100ml CH3COOH; nƣớc vừa đủ 1000 ml) trong 30 phút rồi tiến hănh rửa gel bằng dung dịch rửa (70 ml axit axetic; 50 ml methanol; nƣớc vừa đủ 1 lít) cho đến khi thấy câc băng rõ răng.
2.4.10.Xâc ịnh hoạt tính chitinase trín Semi-Native PAGE
Bảng 5. Thănh phần bản gel semi- native PAGE (12,5% polyacrylamide)
Thănh phần Running gel (µl) Stacking gel (µl)
Acrylamide 30% 2100 220 Tris HCl 1,5M pH 8.8 1250 0 Tris HCl 1.5M pH 6.8 0 415 SDS 10% 50 16,5 Nƣớc khử ion 1100 1015 Glycochitin 0.5% 500 0 APS 10% 25 8,35 TEMED 2 0,85
- 10µl mẫu + 10µl loading buffer (0,2M Tris/HCl pH 6,8 có chứa 2% SDS, 20% glycerol vă 0,002% bromophenol)
- Chạy điện di 150V, 40mA
- Sau khi điện di ủ gel trong 20mM Tris/HCl pH 6,8 có chứa 1% Triton X- 100 trong 1h
- Nhuộm với 0,01% Calcoflour 5-10 phút - Rửa sạch với nƣớc ít nhất 1-2h
- Soi dƣới tia UV
2.4.11.Xâc ịnh một số ặc tính c a enzyme chitinase tinh sạch
2.4.11.1. Xâc ịnh nhiệt ộ tối u vă pH tối u
+ Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu, dịch enzyme đê tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% colloidal chitin trong đệm citrate photphat 0,1M pH 6,0; ủ hỗn hợp phản ứng ở câc nhiệt độ khâc nhau từ 20-800C trong 1h. Xâc định hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục2.4.4). Đối chứng lă mẫu enzyme phản ứng ở 370
C. + Để xâc định pH tối ƣu, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất 0,5% colloidal chitin ở câc pH khâc nhau (colloidal chitin đƣợc ủ ở câc đệm có pH khâc nhau từ pH 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9) ở 370C trong 1h. Xâc định hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.11.2. Xâc ịnh ộ bền nhiệt vă ộ bền pH của enzyme chitinase
+ Để xâc định độ bền nhiệt của chitinase, tiến hănh xử lý enzyme ở câc nhiệt độ khâc nhau: 30, 40, 50, 60, 70, 800C trong 15, 30, 45, 60 phút. Xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4). Đối chứng lă mẫu enzyme không qua xử lý nhiệt.
+ Để xâc định độ bền pH của enzyme, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở dung dịch đệm citrat photphate 0,1 M ở câc pH khâc nhau (pH 3-9) trong 15, 30, 45, 60 phút. Hoạt tính của enzyme sau khi xử lý đƣợc xâc định bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4). Đối chứng lă mẫu enzyme không xử lý pH trƣớc khi phản ứng với cơ chất.
2.4.11.3. Ảnh h ởng của câc ion kim loại
Để xâc định ảnh hƣởng của câc ion kim loại lín hoạt tính chitinase, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ với cơ chất colloidal chitin 0,5% vă dung dịch câc ion kim
370C trong 1h. Xâc định hoạt độ enzyme bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4).
2.4.11.4. Khả năng phđn cắt cơ chất của chitinase
+ Để xâc định khả năng phđn cắt của chitinase lín cơ chất, ta tiến hănh ủ enzyme với hexose của N-acetylglucosamin trong đệm citrat photphat 0,1M pH 6,0 ở 370C trong 4h-6h, hỗn hợp đƣờng thu đƣợc sau phản ứng đƣợc phđn tích bằng phƣơng phâp chạy sắc ký bản mỏng TLC.
2.4.12. Phđn loại ch ng nấm sợi nghi n cứu
2.4.12.1. Xâc inh tín loăi của chủng nấ bằng hình thâi h c
Chuẩn bị mẫu:
La men; Lam kính; Xanh metylen; Đỉn đốt bằng ga; Que sắt nhỏ lấy mẫu; Kính hiển vi điện tử
Câch lăm
+ Cấy điểm giống nấm sợi từ ống nghiệm thạch nghiíng sang đĩa Petri chứa môi trƣờng LCA, để giống trong tủ 250
C từ 1-2 tuần. + Nhỏ một giọt xanh metylen lín lam kính
+ Hơ que cấy bằng sắt đê khử trùng với đỉn đốt bằng gas
+ Lăm nguội que cấy, lấy giống trong đĩa petri cho lín lam kính đê có sẵn xanh metylen, đậy lamen lín mẫu
+ Soi dƣới kính hiển vi
+ Tiến hănh phđn loại chủng nấm bằng phƣơng phâp quan sât hình thâi, đo kích thƣớc, chụp ảnh. Sau đó so sânh với khóa phđn loại của câc tâc giả uy tín trín thế giới. Tìm ra sự tƣơng đồng giữa hình ảnh của chủng nấm cần phđn loại vă hình ảnh trong sâch, từ đó đƣa ra kết luận.
2.4.12.2. Ph ơng phâp phđn t ch trình t ADNr28S
+ Đệm phâ tế băo: 100mM Tris- HCl; 30mM EDTA vă 0,5 % SDS (pH8) + 2,5 M kali axetat (pH 7,5)
+ CHCl3-Izoamyl alcohol (24:1 v/v) + 2-propanol
+ 70 % ethanol
+ Dung dịch TE: 10mM Tris-HCl; 1mM EDTA
- Tâch ADN tổng số
Chủng nấm sợi đƣợc nuôi trín môi trƣờng PDA ở 280C trong 1 tuần; lấy sinh khối cho văo 100 µl đệm phâ tế băo trong ống eppendorf 1,5 ml, trộn đều bằng mây vortex. Đun ở 1000
C trong vòng 15 phút. Thím 100 µl axetat kali, trộn đều vă đặt trín đâ 1giờ, ly tđm lạnh 40C ở 15000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy phần nổi phía trín. Thím 200 µl CHCl3-Izoamyl alcohol, trộn đều, ly tđm 15000vòng/phút trong 2 phút. Sau đó lấy phần nổi phía trín, lăm lại nhƣ vậy lần nữa. Thím 200 µl 2- propanol (Izo-propanol) vă đặt trong tủ đâ 20 phút. Ly tđm 15000vòng/phút trong 15 phút vă lấy kết tủa. Rửa sạch kết tủa bằng ethanol 70%. Ly tđm 15000 vòng/phút trong vòng 10 phút vă lấy kết tủa. Lăm khô tủa trong 10 phút. Hòa tan tủa trong TE (30-50 µl), giữ trong tủ lạnh 40C trong 1 ngăy. Giữ ở -200C trƣớc khi sử dụng.
- Thực hiện phản ứng PCR (polymerase chain reaction) + Hỗn hợp phản ứng Đệm 10× Ex Taq Tm 10 µl dNTP mixture (2,5 mM) 8 µl Mồi xuôi (10pM) 1 µl Mồi ngƣợc (10pM) 1 µl
Takara Ex TaqTm(5 unit/ µl) 0,5 µl Mẫu 0,5 µl Nƣớc cất đến 100 µl + Chu trình cho phản ứng PCR
1 94 3 phút
2 Lặp lại chu kỳ sau
94 55 72 30 giđy 1 phút 2 phút 30 giđy 3 72 10 phút 4 4 - Mồi cho phản ứng PCR
+ Mồi cho phản ứng PCR câc vùng ITS-D1D2 ADNr [35,63]: Mồi xuôi ITS1: 5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3' Mồi ngƣợc NL4: 3'- GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 5'
+ Kiểm tra câc sản phẩm của PCR bằng điện di. Đun tan 1%agarose trong dịch 1xTAE (dung dịch 50x TAE: 2ml; nƣớc cất: 98ml; agaro:1g) để ấm, đổ văo khuôn đê cắm lƣợc, đợi cho nguội vă đặt tấm gel văo trong mây điện di. Lấy 1µl dung dịch 6x đệm nhồi, trộn đều với 1 µl mẫu, nhỏ văo giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cƣờng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngđm trong dung dịch ethidium bromua (nồng độ 0,5µl/ml) 20 phút, vớt ra quan sât. Quan sât trín mây soi gel.
+ Tinh sạch sản phẩm PCR. Câc mẫu sau khi PCR đê đƣợc kiểm tra qua điện di, chọn mẫu có một băng duy nhất vă có cùng kích thƣớc với băng xâc định trín thang chuẩn.
Câc mẫu đƣợc tinh sạch bằng kit QIA gen theo chỉ dẫn của nhă sản xuất. Thím dung dịch PBI văo mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều, đƣa văo cột, ly tđm 13000vòng/phút trong 30 giđy. Đổ bỏ dịch phía dƣới cột. Bổ sung 150 µl PE lín
cột. Ly tđm 13.000v/ph trong 30 giđy. Đổ bỏ dịch dƣới cột. Ly tđm tiếp 13.000v/ph trong 2 phút. Chuyển cột sang ống eppendoft mới. Thím 30 µl nƣớc. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tđm 13.000v/ph trong 1 phút. Lấy dịch phía dƣới.
+ Xâc định nồng độ ADN: lấy 5µl dịch mẫu đo nồng độ ADN bằng mây đo UV ở câc bƣớc sóng 260 vă 280 nm. Chọn mẫu có nồng độ > 20µg/ml, độ tinh sạch 1,8.
- Đọc trình tự ADN.
+ Phản ứng khuếch đại mẫu đọc trình tự ADN.
Câc sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing vă đệm 5X giải trình tự ( Perkin-Elmer Appied Biosystem) với hỗn hợp phản ứng:
Terminator Ready Reaction Mix-8µl; mẫu (50µg/ml)-1µl; mồi-1µl; nƣớc cất- đủ đến 20 µl.
+ Mồi cho phản ứng PCR câc vùng ITS (Internal transcribed spacer) [63]: Mồi xuôi ITS1: 5' - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3'
Mồi ngƣợc ITS4: 5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3' + Mồi cho xâc định trình tự đoạn D1/D2 ADNr 28S [35]:
Mồi xuôi NL1: 5'-GCATATCATAAGCGGAGGAAAAG-3' Mồi ngƣợc NL4: 3'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-5'
+ Chu trình cho phản ứng PCR
Bƣớc tiến hănh Nhiệt độ(0C) Thời gian
1 94 1 phút
2 Lặp lại chu kỳ sau
96 50 60 10 giđy 5 giđy 1 phút
3 4 -
Tinh sạch sản phẩm cho giải trình tự: Mẫu đƣợc chuyển sang ống Eppendoft 1,5 ml. Thím 5 µl EDTA 1,25 M, thím 6 µl etanol 100%. Trộn thật nhẹ nhăng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tđm 15000vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trín. Rửa bằng 100 µl ethanol 70%. Ly tđm 15000 vòng/phúttrong 10 phút. Lăm khô mẫu bằng mây cô quay chđn không trong 3-5 phút.
+ Đọc trình tự ADN: Trình tự của ADNr 28S của chủng nấm đƣợc đọc trực tiếp trín mây đọc trình tự tự động ABI 3100Avant. Trình tự nucleic của câc chủng nấm sợi đƣợc so sânh với câc trình tự đê có sẵn trong GenBank.
+ Xđy dựng cđy phât sinh chủng loại: So sânh vă xử lý số liệu dựa văo chƣơng trình mây tính CLUSTAL X ver. 1.83 để phđn tích. Cđy phả hệ đƣợc tính toân theo phđn tích dữ liệu của Kimura sử dụng thuật toân neighbor-joining. Phđn tích bootstrap đƣợc thực hiện 1000 nhóm ngẫu nhiín. Cđy phât sinh chủng loại đƣợc dựng dựa văo phần mềm NJPlot.
Chƣơng 3- KẾT QUẢ VĂ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CÂC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG PHĐN
HỦY CHITIN CAO
Trong nghiín cứu năy, 438 chủng nấm sợi từ Bảo tăng giống chuẩn - Viện Vi Sinh vật vă Công nghệ Sinh học –Đại học Quốc gia Hă Nội đƣợc sử dụng để nghiín cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase.
438 chủng nấm sợi trín đƣợc tiến hănh săng lọc bằng phƣơng phâp đo vòng phđn giải môi trƣờng thạch cơ chất (mục2.4.1). Kết quả đƣợc trình băy ởBảng 6.
Bảng 6. Hoạt tính enzyme chitinase của 438 chủng nấm sợi nghiín cứu Hoạt tính enzyme chitinase Số ch ng Tỷ lệ (%) Mạnh 44 10,04 Trung bình 202 46,11 Yếu 152 34,7 Không 40 9,1 Tổng 438 100% Ghi chú
hông có hoạt tính đường kính v ng phđn giải 2mm
Hoạt tính enzyme yếu 2 mm đường kính v ng phđn giải 10mm
Hoạt tính enzyme trung bình 10 mm < đường kính v ng phđn giải 20mm Hoạt tính enzyme mạnh 20 mm < đường kính v ng phđn giải
Qua Bảng 6 cho thấy hầu nhƣ 438 chủng nấm sợi đều có khả năng phđn giải cơ chất chitin với mức độ phđn giải khâc nhau, chỉ có 40/438 chủng (chiếm tỷ lệ 9,1%) lă không có khả năng phđn giải cơ chất chitin. 44chủng có hoạt tính enzyme chitinase cao nhất sẽ đƣợc chọn cho câc nghiín cứu tiếp theo.
3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA 44 CHỦNG NẤM SỢI ĐÊ TUYỂN CHỌN NẤM SỢI ĐÊ TUYỂN CHỌN
44 chủng nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong 6 ngăy trín môi trƣờng lín men dịch thể MT1 (mục 2.3.4) tại nhiệt độ 280C, lắc 220 vòng/phút, sau đó thu dịch nuôi cấy đem ly tđm lạnh 40C, 10000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch enzyme thô. Xâc định hoạt tính enzyme bằng phƣơng phâp định tính (mục2.4.3). Kết quả đƣợc thể hiện tạiBảng 7.
Bảng 7. ết quả hoạt tính enzyme của 44 chủng nấm sợi nghiín cứu trín
MT1 T n ch ng Vòng phđn giải cơ chất (D-d, mm) T n ch ng Vòng phđn giải cơ chất (D-d, mm) VN10-1005 32 VN10-1270 32 VN10-1019 26 VN10-1273 29 VN10-1025 25 VN10-1289 23 VN10-1035 31 VN10-1290 28 VN10-1039 28 VN10-1338 26 VN10-1111 25 VN10-1340 25 VN10-1152 27 VN10-1350 25 VN10-1159 23 VN10-1355 27 VN10-1180 27 VN10-1378 28 VN10-1134 30 VN10-1390 26 VN10-1192 31 VN10-1395 30 VN10-1197 27 VN10-1428 22 VN10-1201 30 VN10-1461 33 VN10-1209 27 VN10-1476 30 VN10-1217 31 VN10-1479 28 VN10-1245 28 VN10-1484 35 VN10-1250 31 VN10-1488 27
VN10-1103 36 VN10-1336 33
VN10-1232 32 VN10-1106 32
VN10-1380 32 VN10-1360 32
VN10-1325 29 VN10-1492 33
VN10-1294 30 VN10-1480 31
Qua đânh giâ hoạt tính phđn giải chitin của 44 chủng nấm sợi trín, 10 chủng nấm sợi có hoạt tính chitinase cao nhất (với kích thƣớc vòng phđn giải từ 30 mm trở lín)đƣợc chọn ra để tiếp tục nghiín cứu.
Hình 6. hả n ng phđn giải cơ chất chitin của c c chủng nấm sợi
1. VN10-1294 2. VN10-1103 3. VN10-1484 4. VN10-1360 5. ĐC
3.3. ĐỊNH LƢỢNG CHITINASE 10 CHỦNG NẤM SỢI TUYỂN CHỌN
Trong thí nghiệm trƣớc, hoạt tính chitinase chỉ đƣợc đânh giâ dựa trín khả năng vòng phđn giải chitin. Phƣơng phâp năy chỉ cho phĩp xâc định ở mức độ định tính. Vì vậy để có thể đânh giâ chính xâc hơn, tiến hănh định lƣợng hoạt tính enzyme của 10 chủng nấm sợi đê đƣợc lựa chọn. Kết quả định lƣợng hoạt tính enzyme đƣợc thể hiện tại Bảng 8.
2
5
1
3 4
Bảng 8. Hoạt tính chitinase của 10 chủng nấm sợi
Tín chủng Hoạt tínhchitinase (U/ml) Tín chủng Hoạt tínhchitinase (U/ml)
VN10-1005 30,7 ± 0,35 VN10-1270 29,3 ± 1,12
VN10-1035 29,8 ± 0,19 VN10-1250 32,0 ± 0,78
VN10-1103 42,3 ± 0,54 VN10-1484 39,9 ± 0,18
VN10-1192 32,5 ± 0,96 VN10-1461 36,3 ± 0,55
VN10-1217 38,6 ± 0,67 VN10-1484 33,4 ±0,32
Căn cứ văo Bảng 8 có thể thấy chủng VN10-1103 lă chủng có hoạt tính cao nhất (42,3 U/ml). Do vậy, chủng VN10-1103 đƣợc lựa chọn để tiến hănh phđn loại vă thực hiện những nghiín cứu tiếp theo.
3.4. NGHIÍN CỨU PHĐN LOẠI CHỦNG VN10-1103
Phđn loại chủng nấm sợi lựa chọn VN10-1103 lă cần thiết cho câc nghiín cứu liín quan đến câc nội dung của đề tăi. Để thực hiện nghiín cứu năy chúng tôi kết hợp nghiín cứu đặc điểm hình thâi vă giải trình tự ADN mê hóa cho gen ITS vă D1D2 thuộc gen ADNr 28S.
3.4.1. Đặc iểm hình thâi
Trín môi trƣờng nuôi cấy, VN10-1103 có khuẩn lạc mău trắng, trín phần lớn câc loại môi trƣờng khâc nhau (LCA, PDA,...) chúng sinh nhiều băo tử khô, dạng bột, tạo thănh một quả cầu trắng, mỗi quả cầu năy gồm một cụm cuống sinh băo tử bện chặt.
Cuống sinh băo tử ngắn, hình trứng thuôn nhọn dần về phía đỉnh, phần gần đỉnh hình thănh băo tử, khi băo tử rời khỏi cuống sinh băo tử tạo thănh hình răng cƣa, phần năy kĩo dăi theo sự hình thănh băo tử, tạo thănh hình zigzag. Băo tử khô vă kị nƣớc, kích thƣớc 2-3 µm.
A B
Hình 7. Hình ảnh khuẩn lạc (A) vă băo tử (B) chủng VN10-1103 3.4.2. Phđn loại dựa tr n phƣơng phâp sinh học phđn tử
Chủng VN10-1103 đƣợc nuôi trín môi trƣờng PDA ở 28°C, sau 5 ngăy thu sợi nấm vă tiến hănh tâch ADN tổng số. Sử dụng cặp mồi ITS1 vă NL4 để nhđn đoạn genbao gồm cả gen ITS vă phần D1D2 của ADNr 28S. Kết quả chúng tôi thu đƣợc đoạn gen có kích thƣớc khoảng 1200bp.
Hình8.Sản phẩmPCR ITS –D1D2 ADNr của chủng VN10-1103 trín gel agarose
Trình tự gen ADNr đoạn ITS vă D1D2 của chủng VN10-1103 đƣợc trình băy tại mục 1 vă mục 2 phần phụ lục.
Trình tự năy có độ tƣơng đồng 100 % (1200/1200) so với chủng Beauveria bassiana AY531983.
Hình 9. Cđy ph t sinh chủng loại của chủng VN10-1103 vă c c loăi có mối
quan hệ họ hăng gần, cđy được xđy dựa văo phđn tích trình tự gen ADNr dựa văotrình tự đoạn ITS vă D1D2
3.5. LỰA CHỌN MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH TỔNG HỢP
CHITINASE CỦA CHỦNG VN10-1103
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy
Trong điều tra sinh hóa về khả năng sản xuất enzyme của vi sinh vật, câc thănh phần môi trƣờng nuôi cấy đóng vai trò quan trọng cho sự tăng trƣởng cũng nhƣ sản xuất câc chất chuyển hóa.
Chủng VN10-1103 đƣợc nuôi lắc 220 vòng/phút trín 6 môi trƣờng khâc