Phđn loại chủng nấm sợi lựa chọn VN10-1103 lă cần thiết cho câc nghiín cứu liín quan đến câc nội dung của đề tăi. Để thực hiện nghiín cứu năy chúng tôi kết hợp nghiín cứu đặc điểm hình thâi vă giải trình tự ADN mê hóa cho gen ITS vă D1D2 thuộc gen ADNr 28S.
3.4.1. Đặc iểm hình thâi
Trín môi trƣờng nuôi cấy, VN10-1103 có khuẩn lạc mău trắng, trín phần lớn câc loại môi trƣờng khâc nhau (LCA, PDA,...) chúng sinh nhiều băo tử khô, dạng bột, tạo thănh một quả cầu trắng, mỗi quả cầu năy gồm một cụm cuống sinh băo tử bện chặt.
Cuống sinh băo tử ngắn, hình trứng thuôn nhọn dần về phía đỉnh, phần gần đỉnh hình thănh băo tử, khi băo tử rời khỏi cuống sinh băo tử tạo thănh hình răng cƣa, phần năy kĩo dăi theo sự hình thănh băo tử, tạo thănh hình zigzag. Băo tử khô vă kị nƣớc, kích thƣớc 2-3 µm.
A B
Hình 7. Hình ảnh khuẩn lạc (A) vă băo tử (B) chủng VN10-1103 3.4.2. Phđn loại dựa tr n phƣơng phâp sinh học phđn tử
Chủng VN10-1103 đƣợc nuôi trín môi trƣờng PDA ở 28°C, sau 5 ngăy thu sợi nấm vă tiến hănh tâch ADN tổng số. Sử dụng cặp mồi ITS1 vă NL4 để nhđn đoạn genbao gồm cả gen ITS vă phần D1D2 của ADNr 28S. Kết quả chúng tôi thu đƣợc đoạn gen có kích thƣớc khoảng 1200bp.
Hình8.Sản phẩmPCR ITS –D1D2 ADNr của chủng VN10-1103 trín gel agarose
Trình tự gen ADNr đoạn ITS vă D1D2 của chủng VN10-1103 đƣợc trình băy tại mục 1 vă mục 2 phần phụ lục.
Trình tự năy có độ tƣơng đồng 100 % (1200/1200) so với chủng Beauveria bassiana AY531983.
Hình 9. Cđy ph t sinh chủng loại của chủng VN10-1103 vă c c loăi có mối
quan hệ họ hăng gần, cđy được xđy dựa văo phđn tích trình tự gen ADNr dựa văotrình tự đoạn ITS vă D1D2
3.5. LỰA CHỌN MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH TỔNG HỢP
CHITINASE CỦA CHỦNG VN10-1103
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy
Trong điều tra sinh hóa về khả năng sản xuất enzyme của vi sinh vật, câc thănh phần môi trƣờng nuôi cấy đóng vai trò quan trọng cho sự tăng trƣởng cũng nhƣ sản xuất câc chất chuyển hóa.
Chủng VN10-1103 đƣợc nuôi lắc 220 vòng/phút trín 6 môi trƣờng khâc nhau MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6 (mục2.4.7.1) pH 7, ở 280C, trong 6 ngăy. Thu dịch nuôi cấy, ly tđm lạnh 40C, 10000 vòng/ phút trong 15 phút. Xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng. Kết quả đƣợc trình băy ở Bảng 9.
Aspergillus sojae JQ812703 Paecilomyces tenuipes AY037301. Paecilomyces farinosus AF237664 Paecilomyces fumosoroseus AY624183
100 J Cordyceps scarabaeicola N04982 C. scarabaeicola AY245639 B. amorpha HQ880808 B. morpha Q880807 B. caledonica DQ449652 100 B. brongniartii HQ880777 B. bassiana AY531983 VN10 - 1103 98 73 72 100 93 100 100 0.05
Bảng 9. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 trín c c môi trường nuôi cấy
STT Môi trƣờng Hoạt độ chitinase (U/ml)
1 MT1 19,20 ± 0,22 2 MT2 49,70 ± 0,18 3 MT3 23,86 ± 0,32 4 MT4 13,31 ± 0,17 5 MT5 25,89 ± 0,26 6 MT6 14,66 ± 0,32
Qua Bảng 9 cho thấy chủng VN10-1103 có khả năng sinh tổng hợp chitinase trín cả 6 môi trƣờng MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6. Trín 2 môi trƣờng MT4 vă MT6 chủng VN10-1103 cho hoạt tính chitinase khâ thấp (13-15 U/ml) trong khi đó trín môi trƣờng MT2 thì chủng năy lại sinh tổng hợp chitinase khâ mạnh (hoạt tính đạt 49,7 U/ml). Điều năy cho thấy môi trƣờng MT2 lă môi trƣờng thích hợp nhất cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp chitinase. Môi trƣờng 2 đƣợc chọn lăm môi trƣờng nuôi cấy cho câc nghiín cứu tiếp theo.
3.5.2. Lựa chọn pH môi trƣờng
Chủng VN10-1103 đƣợc nuôi lắc 220 vòng/phút trín môi trƣờng 2 (MT2), 280C ở câc pH khâc nhau: 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 vă 9. Sau 6 ngăy, thu dịch nuôi cấy, ly tđm để thu enzyme chitinase thô, xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục2.4.4). Kết quả đƣợc trình băy ở Hình 10.
Hình 10. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 nuôi cấy trín c c pH
môi trường kh c nhau
Kết quả ở Hình 10cho thấy chủng VN10-1103 có khả năng sinh chitinase tốt ở dải pH từ pH 5,5- 8, tốt nhất ở pH 7 (49,94 U/ml), ở câc pH từ pH 3- 5 thì khả năng sinh chitinase của chủng năy thấp (đạt khoảng 16-25 U/ml), ở pH 8,5; 9 thì khả năng sinh chitinase của chủng VN10-1103 giảm rõ rệt, chỉ còn khoảng 13-16 U/ml.
Kết quả năy phù hợp với kết quả nghiín cứu pH môi trƣờng thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chitinase của Bacillus subtilis (S.Kavi Karunya vă cộng sự, 2013) [33] vă Streptomyces hygroscopicus (Priya C.S vă cộng sự, 2011) [53].
3.5.3. Lựa chọn nhiệt ộ nuôi cấy
Nuôi cấy lắc chủng VN10-1103 trín môi trƣờng 2 (MT2) pH 7, tốc độ 220 vòng/phút ở câc nhiệt độ khâc nhau: 15, 20, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 500C trong thời gian 6 ngăy. Thu dịch nuôi cấy, ly tđm lạnh 40C, 10000vòng /phút trong 15 phút, thu dịch enzyme thô. Xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng
0 20 40 60 80 100 120 0 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 10 U/ml pH
Hình 11. Hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 nuôi cấy ở c c nhiệt độ
khâc nhau
Kết quả Hình11 cho thấy chủng VN10-1103 có khả năng sinh chitinase mạnh ở dải nhiệt từ 25- 350C, đặc biệt từ 15- 280C, hoạt độ enzyme tăng dần lín khi tăng nhiệt độ đến 280
C vă bắt đầu giảm xuống khi tiếp tục tăng nhiệt độ. Nhƣ vậy, nhiệt độ thích hợp nhất cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp enzyme chitinase lă 280C.
Kết quả năy phù hợp với kết quả nghiín cứu của Pankaj Patidar (2004) trín chủng Beauveria felina RD101[50] vă nghiín cứu của P.V. Suresh trín chủng
Beauveria basinana BTMF S10[60]. Cũng tƣơng tự, nhiệt độ tối ƣu cho Bacillus licheniformisvă Bacillus subtilissản sinh chitinase lă 300
C(Eman Zakaria Gomaa vă cộng sự, 2012) [24].
Qua những kết quả trín cho thấy nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật sản sinh chitinase hầu nhƣ phụ thuộc văo nhiệt độ sinh trƣởng của vi sinh vật, bởi khi vi sinh vật sinh trƣởng tốt thì quâ trình tổng hợp enzyme cũng đƣợc thúc đẩy để phđn hủy cơ chất chitin có mặt trong môi trƣờng.
0 10 20 30 40 50 60 70 15 20 25 28 30 35 40 45 50 U/ml oC
3.5.4. Lựa chọn nguồn carbon
Carbon lă nguồn dinh dƣỡng rất quan trọng cho sự sinh trƣởng của vi sinh vật. Trong nghiín cứu năy, chủng VN10-1103 đƣợc nuôi lắc 220 vòng /phút trín môi trƣờng 2, pH 7, 250
C, với 1% câc nguồn carbon: chitin, chitosan, colloidal chitin, N-acetyl glucosamine, CMC, tinh bột tan, sucrose, fructose, glucose. Sau 6 ngăy, thu enzyme thô, xâc định hoạt độ chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4). Kết quả đƣợc trình băy ở Hình 12:
Hình 12. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 trín c c nguồn
carbon khâc nhau
Kết quả Hình 12cho thấy khi thay đổi nguồn carbon thì hoạt độ chitinase của chủng VN10-1103 có rất nhiều biến đổi, trong đócolloidal chitin lă nguồn carbon cho hoạt độ enzyme cao nhất (60,87 U/ml). Trín câc nguồn carbon khâc nhƣ chitin, chitosan, chủng VN10-1103 cho hoạt độ cao hơn hẳn so với câc nguồn carbon nhƣ sucrose, CMC hay fructose do trín câc nguồn cơ chất đó chúng phải tiết ra nhiều chitinase để thủy phđn cơ chất cung cấp cho sự sinh trƣởng vă phât triển.Trín môi trƣờng có sử dụng nguồn carbon lă N-acetyl glucosamine, lƣợng chitinase sinh ra
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 U/ml
không nhiều (xấp xỉ lƣợng chitinase do chủng năy tiết ra khi sử dụng nguồn carbon lă CMC) do có thể nguồn carbon năy lă đƣờng đơn vă chủng VN10-1103 có thể dễ dăng sử dụng mă không cần sự thủy phđn nhờ chitinase.Do đó, colloidal chitin đƣợc sử dụng lăm nguồn carbon cho sự sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 trong câc nghiín cứu tiếp theo.
Kết quả năy cũng phù hợp với hai nghiín cứu trƣớc đó của Havukkala vă cộng sự (1993) [28] vă Priyanka Dhar cùng cộng sự (2010) [21]khi nghiín cứu trín chủng Beauveria bassiana.S. Kavi Karunya vă cộng sự (2011) cũng xâc định colloidal chitin lă nguồn cacbon tối ƣu cho Bacillus subtilis sinh tổng hợp chitinase[33].
3.5.5. Nồng ộ nguồn carbon phù hợp
Sau khi xâc định đƣợc colloidal chitin lă nguồn carbon có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao nhất trong số câc nguồn carbon đê đƣợc khảo sât, colloidal chitin đƣợc đƣa văo môi trƣờng nuôi cấy với câc nồng độ khâc nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2%. Sau 6 ngăy nuôi cấy, thu dịch enzyme thô, xâc định hoạt tính bằng phƣơng phâp định lƣợng (mục 2.4.4). Kết quả đƣợc trình băy ở Hình 13. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 U/ml %
Hình 13. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy ở c c
nồng độ colloidal chitin khâc nhau
Kết quả Hình 13cho thấy khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10- 1103 đạt mức cao nhất ở nồng độ colloidal chitin 0,6%, hoạt tính enzyme lúc năy đạt 92,46 U/ml gấp 1,5 lần so với mẫu đối chứng ban đầu (nồng độ colloidal chitin 1%). Sau khi nồng độ colloidal chitin tăng quâ 0,6%, khả năng sản sinh chitinase của chủng năy không những không tăng mă còn giảm đi rõ rệt.
Nồng độ colloidal chitin thích hợp cho câc chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase lă rất khâc nhau, ví dụ đối với Bacillus amyloliquefaciens SM3 lă 0,5% [19]; với Bacillus subtilis lă 0,3% [34]; trong khi đó ở Streptomyces aureofaciens lă 1% [59] vă ở nấm Trichoderma viride lă 1,5%[57].
3.5.6. Lựa chọn nguồn nitơ
Chủng nấm sợi VN10-1103 đƣợc nuôi cấy trín môi trƣờng tối ƣu thay đổi câc nguồn nitơ khâc nhau bao gồm: peptone, cao men, cazein, (NH4)2SO4, NH4Cl, KNO3, NaNO3 ở nồng độ 1% ở 250C, pH 7, sử dụng chitin 0,6% lăm nguồn cacbon. Sau 6 ngăy thu dịch enzyme thô, xâc định hoạt độ bằng phƣơng phâp định lƣợng chitinase. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 10:
Bảng 10. hả n ng sinh chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi cấy trín
c c nguồn nitơ kh c nhau
STT Nguồn nitơ Hoạt độ chitinase (U/mL)
1 (NH4)2SO4 28,22 ± 0,45 2 NaNO3 14,10 ± 0,29 3 Cao men 106,71 ± 0,09 4 Cazein 38,10 ± 0,17 5 Ure 34,50 ± 0,38 6 Pepton 96,23 ± 0,06
Kết quả ở Bảng 10 cho thấy hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 tăng khi đƣợc nuôi cấy trín môi trƣờng sử dụng nguồn nitơ lă cao men, hoạt độ enzyme đạt 106,71 U/ml. Bín cạnh đó, chủng VN10-1103 cũng sinh tổng hợp chitinase khâ tốt khi nuôi cấy trín môi trƣờng có nguồn nitơ lă pepton (hoạt độ đạt 96,23 U/ml) nhƣng khi nuôi cấy chủng năy trín môi trƣờng với nguồn nitơ lă (NH4)2SO4 vă NaNO3, ure thì hoạt tính chitinase lại giảm đi rõ rệt, hoạt tính lúc năy chỉ đạt 14- 34,5 U/ml. Nhƣ vậy, cao nấm men đƣợc chọn lăm nguồn nitơ cho quâ trình nuôi cấy thu enzyme chitinase.
Kết quả năy hoăn toăn phù hợp với nghiín cứu trƣớc đó về nguồn nitơ thích hợp cho Beauveria bassiana sản sinh chitinase(Priyanka vă cộng sự ,2010) [21]. Đồng thời, cao nấm men cũng đƣợc xâc định lă nguồn nitơ tốt nhất cho một số chủng vi sinh vật khâc sinh tổng hợp chitinase nhƣ: Serratia marcescens [17];
Metarhizium anisopliae [20].
3.5.7. Ảnh hƣởng c a nồng ộ nitơ
Sau khi đƣợc xâc định lă nguồn nitơ tối ƣu cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp chitinase, cao nấm men đƣợc đƣa văo môi trƣờng với câc nồng độ khâc nhau: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2% để khảo sât. Sau 6 ngăy nuôi cấy, thu dịch enzyme vă xâc định hoạt tính chitinase bằng phƣơng phâp định lƣợng. Kết quả đƣợc biểu thị trínHình 14: 0 20 40 60 80 100 120 140 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 U/ml %
Hình 14. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 khi nuôi
cấy trín c c nồng độ cao nấm men kh c nhau
Hình 14cho thấy ở nồng độ nitơ từ 0,8-1,2% thì hoạt độ chitinase khâ cao, đạt từ 99,5-124,5 U/ml, trong đó tại nồng độ nitơ 1,2% thì chủng VN10-1103 có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh nhất (đạt 124,5 U/ml). Trong khi đó, ở nồng độ nitơ thấp hơn so với đối chứng (1%) thì hoạt tính chitinase lại giảm mạnh (chỉ còn từ 20-45 U/ml), giảm gần 60% so với ban đầu. Có thể thấy từ nồng độ cao nấm men 1,2%, tiếp tục tăng nồng độ nitơ trong môi trƣờng thì hoạt tính chitinase của chủng VN10-1103 có xu hƣớng giảm.
3.5.8. Ảnh hƣởng c a thời gian nuôi cấy
Tiến hănh nuôi cấy chủng VN10-1103 với câc điều kiện tối ƣu: môi trƣờng MT2, pH 7, lắc 220 vòng/phút ở 280C, nguồn carbon tối ƣu lă chitin 0,6%, nguồn nitơ tối ƣu lă cao nấm men 1,2% ở câc khoảng thời gian khâc nhau: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ngăy. Thu dịch enzyme vă tiến hănh định lƣợng xâc định hoạt tính chitinase (mục 2.4.4). Kết quả định lƣợng đƣợc thể hiện ở Hình 15.
Hình 15. hả n ng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 tại c c
thời gian nuôi cấy
Hình 15cho thấy khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng VN10-1103 tăng theo thời gian nuôi cấy. Trong khoảng 1-2 ngăy đầu nuôi cấy, lƣợng enzyme
0 20 40 60 80 100 120 140 160 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 U/ml Ngăy
chitinase đƣợc tổng hợp rất ít (hoạt tính chỉ đạt 12-14 U/mL). Đến ngăy nuôi cấy thứ 3, lƣợng enzyme sinh ra trong môi trƣờng nuôi cấy tăng dần vă tăng nhanh cho đến ngăy thứ 7, lúc năy hoạt tính enzyme đạt mức cao nhất (131,82 U/ml), lƣợng enzyme sinh ra giảm nhẹ khi nuôi cấy sang ngăy thứ 8 vă sau đó giảm dần ở câc ngăy tiếp theo.Nhƣ vậy 7 ngăy chính lă thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng VN10-1103 sinh tổng hợp enzyme chitinase.
Kết quả năy trùng với thời gian tối ƣu cho Agrobacterium tumefaciens mang gen Bbchit1 của Beauveria bassiana sinh tổng hợp chitinase [52] nhƣng lại khâc với kết quả nghiín cứu của Virgínia Michelle Svedese vă cộng sự trín chủng
Beauveria bassiana (4 ngăy)[58] vă nghiín cứu của Pankaj Patida vă cộng sự (2005) trín đối tƣợng Beauveria felina RD101 (6 ngăy) [50].
3.6. TINH SẠCH SƠ BỘ CHITINASE
Enzyme chitinase VN10-1103 đƣợc tinh sạch qua 2 bƣớc, bƣớc đầu lă cô đặc vă loại bỏ một số hợp chất có trọng lƣợng phđn tử nhỏ hơn 10 kD. Kết quả cho thấy, bằng măng siíu lọc có thể tinh sạch đƣợc một phần chitinase, độ tinh sạch lă 1,07 lần.
Sau đó enzyme năy đƣợc đƣa văo cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephacel. Câc bƣớc tiến hănh đƣợc mô tả phần phƣơng phâp (mục 2.4.8). Kết quả tinh sạch enzyme chitinase VN10-1103 đƣợc thể hiện ởBảng 11, Hình 16 vă Hình 17.
Bảng 11. ết quả tinh sạch chitinase từ B.bassiana VN10-1103
Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg/ml) Hoạt tính enzyme Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) U/ml U/mg Dịch thô 1,94 141,20 72,78 1,0 100 Măng si u lọc 1,54 119,92 77,87 1,07 84,92 DEAE-Sephacel 0,136 55,3 406,62 5,58 39,2
Hình 16. Biểu đồ biểu thị c c phđn đoạn trong tinh sạch chitinase VN10-1103
Kết quả Bảng 11 vă Hình 16cho thấy, enzyme chitinase thô của chủng VN10-1103 khi đi qua cột sắc ký DEAE-Sephacel, cho 4 đỉnh protein ở câc phđn đoạn 6, 11,14. Tuy nhiín, đỉnh hoạt tính lại có 2: phđn đoạn 6 vă 14.
Đỉnh protein ở phđn đoạn 6 đạt 0,136mg/ml, hoạt tính đạt 55,3U/ml. Độ tinh sạch của phđn đoạn năy tăng lín 5,58 lần. Kiểm tra bằng SDS PAGE, phđn đoạn năy gồm một băng duy nhất, kích thƣớc khoảng 45 kDa. Kết quả năy trùng với kích thƣớc của nghiín cứu trƣớc đó của Havukkala vă cộng sự về chitinase do Beauveria
sinh ra [28].
Ở phđn đoạn 14, nồng độ protein đạt 0,049 mg/ml, hoạt tính đạt khoảng 9,59U/ml. Tuy nhiín, do nồng độ protein quâ thấp nín khi điện di trín SDS PAGE, chúng không đƣợc biểu hiện.
Hình17. Sản phẩm điện di SDS-PAGE (A) vă Semi-native PAGE (B) của chitinase
VN10-1103
A: Băng 1: Marker; Băng 2: Dịch chitinase thô; Băng 3: Dịchchitinasetinh sạch
B (Semi-native PAGE): Băng 2: phđn đoạn 6
3.7. NGHIÍN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TINH
SẠCH
3.7.1. pH tối ƣu cho hoạt ộng c a enzyme
pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tâc của enzyme, vì nó ảnh hƣởng lớn đến mức độ ion hóa cơ chất vă ảnh hƣởng tới độ bền protein enzyme. Để khảo sât sự ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới hoạt động của chitinase, phản ứng giữa dịch enzyme chitinase tinh sạch vă cơ chất colloidal chitin 0,5% đƣợc thực hiện ở câc pH khâc nhau: 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; ở 370C trong