3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Xác định hoạt tính α-amilase
Hạt mầm đậu Nho nhe bóc vỏ, cân khoảng 2g nghiền trong cối sứ và bổ sung 1,8 ml dung dịch đệm photphat citrate pH = 6,8; lắc đều và để 5-10 phút rồi li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C thu dịch trong (dịch enzyme).
Hoạt tính α-amylase được định lượng bằng cách đo hàm lượng đường glucose giải phóng khi thủy phân tinh bột bởi enzyme theo phương pháp của Miller (1959) [25]. Lượng đường giải phóng được xác định bằng cách đo độ hấp phụ ở 540 nm, dựa vào cường độ màu tạo phức với thuốc thử. Tiến hành đo như sau:
Ống thí nghiệm: 0,5 ml tinh bột 1,0% pha trong 20 mM đệm photphat pH 6,0 được cho vào ống nghiệm sau đó thêm 0,5 ml dịch enzyme. Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5-10 phút ở 40C sau đó bổ sung 1,0 ml DNS và đun sôi trong 5 phút. Để lạnh, sau đó hỗn hợp đo ở bước sóng 540 nm.
Ống kiểm tra: Hút 0,5 ml tinh bột 1,0% pha trong 20 mM đệm photphat pH 6,0 sau đó thêm các hóa chất định lượng đường khử và bổ sung 0,5 ml dịch enzyme và tiến hành tương tự như ống thí nghiệm.
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ glucose theo phương pháp Miller
Dựng đường chuẩn: Glucose được pha trong đệm natri acetate 100mM; pH 5,0 với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-100 µg/ml. Một ml dung dịch chuẩn được đo ở bước sóng 540 nm. Độ hấp phụ và nồng độ glucose được vẽ theo chương trình Excel. Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10-100 µg/ml. Đường chuẩn có phương trình y = 0,048x -
0,024 (Hình 2.1). Trong đó, y là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ glucose (µg/ml).
Đơn vị hoạt tính (U) là lượng enzyme phân giải cơ chất tinh bột thành đường khử tương đương 1g glucose trong 1 phút ở 40C.