3. Nội dung nghiên cứu
3.1.2.3. Hình thái giải phẫu của lá
Kết quả giải phẫu lá nhận thấy, các giống đậu Nho nhe thu tại Điện Biên, Lai Châu, Sơn La gồm các lớp: Biểu bì, mô dày, mô mềm vỏ, mô cứng, libe sơ cấp và gỗ sơ cấp.
(1) Biểu bì là lớp ngoài cùng, được cấu tạo gồm những tế bào hình chữ nhật, xếp xít nhau, không có lục lạp, có chức năng bảo vệ; phía ngoài biểu bì có lông. (2) Mô giậu gồm 2-3 lớp tế bào dài, xếp thẳng vuông góc với bề mặt cơ quan, nằm tiếp giáp ngay dưới biểu bì trên, chứa nhiều lục lạp. (3) Mô xốp (còn gọi là mô khuyết) nằm ngay dưới mô giậu và trên biểu bì dưới. (4) Biểu bì dưới có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào bên trong. Lớp mô dày gồm 2-3 lớp tế bào sống, có hình đa giác, vách dày, bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm); các tế bào nằm sát dưới biểu bì chuyên hóa với chức năng cơ học. (5) Lớp libe sơ cấp gồm các tế bào sống (bắt màu hồng của thuốc nhuộm cacmin), có hình đa giác, nhỏ, xếp xít nhau tạo thành một vòng liên tục. (6) Gỗ sơ cấp gồm 8-9 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, có kích thước khác nhau, nằm phía trong libe tạo nên bó xếp chồng. (7) Lớp mô cứng gồm những tế bào có vách dày, xếp liền nhau tạo thành vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học của lá. (8) Lớp mô mềm vỏ gồm 10-11 lớp tế bào có kích thước không đồng đều chiếm phần lớn diện tích. (9) Mô dày gồm 2-3 lớp tế bào sống, có hình đa giác, vách dày, bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm). (10) Lông che chở có chức năng bảo vệ lá (Hình 3.9).
Hình 3.9. Hình thái giải phẫu lá của các giống đậu Nho nhe
1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô xốp; 4. Biểu bì dưới; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Vòng mô cứng; 8. Mô mềm; 9. Mô dày; 10. Lông che chở.
3.2. Hoạt tính α- amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe
α-amylase là enzyme phân giải tinh bột thành đường glucose. Khi hạt nảy mầm α-amylase được tổng hợp và hoạt động mạnh, giúp quá trình phân giải tinh bột diễn ra mạnh mẽ để tổng hợp các chất hữu cơ cho sự hình thành cây non, làm cho hàm lượng đường tăng. Đường tạo thành có vai trò làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, từ đó làm tăng tính chống chịu của thực vật với các yếu tố cực đoan từ môi trường, giúp cây non phát triển bình thường.
Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe từ 8 giống sau 01 ngày được định tính trên đĩa thạch có chứa cơ chất 1,0% tinh bột. Kết quả hình 3.10 nhận thấy, trên đĩa thạch xuất hiện các vòng phân giải cơ chất màu trắng sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm lugol. Đường kính vòng phân giải cơ chất của α-amylase từ các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 1,4-1,7 cm (Bảng 3.2). Như vậy, các giống đậu Nho nhe trong nghiên cứu khi nảy mầm đều có hoạt tính α-amylase.
TT Mẫu đậu Nho nhe Đường kính vòng phân giải cơ chất (cm) 1 NN14-ĐB 1,5 2 NN15-ML 1,7 3 NN16-TP 1,7 4 NN17-QN 1,5 5 NN18-LC 1,5 6 NN19-TC 1,4 7 NN20TC 1,5 8 NN21-TC 1,6
α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe của các mẫu NN14-ĐB, NN16-TP, NN20-TC và NN21-TC được định lượng bằng phương pháp đường khử theo Miller. Kết quả định lượng nhận thấy, hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe của các mẫu NN14-ĐB, NN16-TP, NN20-TC và NN21-TC lần lượt đạt 1,08; 0,21; 0,74 và 0,81 U/mg protein (Bảng 3.3).
Hình 3.10. Định tính α- amylase trên đĩa thạch của các giống đậu Nho nhe
Bảng 3.3. Hoạt tính α-amylase của các giống đậu Nho nhe
1 NN14-ĐB 1,08
2 NN16-TP 0,21
3 NN20-TC 0,74
4 NN21-TC 0,81
Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe trong nghiên cứu này được so sánh với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) [7] nhận thấy, hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe trong nghiên cứu này cao hơn so với các mẫu đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng sau 5 ngày (hoạt tính dao động từ 0,573- 0,941 U/mg protein).
3.3. Hoạt tính enzyme protease từ mầm hạt đậu Nho nhe
Protease là enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình nảy mầm của hạt, sự phát triển của cây non và có liên quan đến khả năng chịu mất nước của tế bào. Nghiên cứu hoạt tính protease từ mầm hạt đậu Nho nhe nhằm đánh giá mối liên quan với hàm lượng protein có trong hạt.
Bảng 3.4. Hoạt tính protease của các giống đậu Nho nhe
TT Mẫu đậu Nho nhe Hoạt tính (U/mg)
1 NN14-ĐB 0,410 2 NN15-ML 0,943 3 NN16-TP 1,135 4 NN17-QN 0,709 5 NN18-LC 0,729 6 NN19-TC 0,828 7 NN20-TC 0,778 8 NN21-TC 1,112
Kết quả khảo sát nhận thấy, hoạt tính protease từ mầm hạt đậu Nho nhe khảo sát ở giai đoạn 2-3 ngày tuổi có hoạt tính dao động từ 0,410-1,135 U/mg protein; trong đó hoạt tính protease cao nhất đạt 1,135U/mg protein ứng với
mẫu đậu Nho nhe NN16-TP thu tại tỉnh Sơn La và thấp nhất là mẫu đậu Nho nhe NN14-ĐB thu tại tỉnh Điện Biên (Bảng 3.4).
Nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) đã xác định hoạt tính protease của 11 giống đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng dao động từ 1,59-2,12 U/mg [7] . Như vậy, hoạt tính protease từ mầm hạt đậu Nho nhe trong nghiên cứu của chúng tôi cao thấp hơn so với nghiên cứu đã công bố.
3.4. Định lượng protein tan
Nghiên cứu hàm lượng protein tan nhằm xác định giá trị dinh dưỡng của đậu Nho nhe và kiểm tra được sự khác biệt về đặc điểm hóa sinh liên quan tới điều kiện thổ nhưỡng. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein tan của 8 mẫu đậu Nho nhe thu tại các tỉnh Điện Biên, Lai Châu, Sơn La có sự khác nhau được thể hiện ở bảng 3.5. Hàm lượng protein tan tổng số của 8 mẫu Nho nhe nghiên cứu dao động từ 43,5-51,2%. Trong đó, mẫu đậu Nho nhe NN14-ĐB có hàm lượng protein tổng số cao nhất đạt 51,5%; tiếp đến là các mẫu NN20-TC, NN21-TC và NN15-ML đạt từ 50,1-50,4%. Hàm lượng protein tổng số thấp nhất là mẫu NN17-QN đạt 43,5%.
Bảng 3.5. Hàm lượng protein tan của các giống đậu Nho nhe
TT Mẫu đậu Nho nhe Hàm lượng protein tan (%)
1 NN14-ĐB 51,2 2 NN15-ML 50,1 3 NN16-TP 48,4 4 NN17-QN 43,5 5 NN18-LC 44,8 6 NN19-TC 44,0 7 NN20-TC 50,4 8 NN21-TC 50,2
Theo nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Quất và cộng sự (2012) đã chỉ ra hàm lượng protein tan tổng số của 10 giống đậu xanh được trồng tại tỉnh Nghệ An
và Hà Tĩnh dao động từ 21,24 - 24,25% [5]. Như vậy, hàm lượng protein của đậu Nho nhe trong nghiên cứu này khác so với kết quả đã công bố.
3.5. Hàm lượng isoflavone từ mầm hạt đậu Nho nhe
Isoflavone là các polyphenol không màu thuộc lớp flavonoid. Isoflavone trong đậu tương gồm daidzein, genistein và glycitein được tổng hợp thông qua con đường phenypropanoid với sự tham gia của nhiều enzyme, trong đó có hai loại enzyme quan trọng tham gia tổng hợp isoflavone được biết đến là chalcone isomerase và isoflavone synthase. Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl. Genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5. Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa học đặc trưng.
Bảng 3.6. Hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi
của 4 mẫu đậu Nho nhe
TT Chất
Mẫu
Daidzein Genistein Isoflavone
(daidzein+ genistein) 1 NN14-ĐB < 10 µg/g < 10 µg/g < 10 µg/g 2 NN18-LC < 10 µg/g < 10 µg/g < 10 µg/g 3 NN20-TC < 10 µg/g < 10 µg/g < 10 µg/g 4 NN21-TC < 10 µg/g < 10 µg/g < 10 µg/g AU 0.00 0.02 0.04 0.06 Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 AU 0.00 0.10 0.20 0.30 Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 A B
AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 AU 0.00 0.20 0.40 0.60 Minutes 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 C D
Hình 3.11. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ mầm hạt đậu
Nho nhe sau 3 ngày tuổi
A: NN14-ĐB; B: NN18-LC; C: NN20-TC; D: NN21-TC
Sử dụng kỹ thuật phân tích HPLC định lượng daidzein và genistein chiết từ hạt đậu Nho nhe nảy mầm 3 ngày tuổi của 4 mẫu từ Sơn La, Lai Châu và Điện Biên từ sắc ký đồ ở hình 3.11 và phương trình đường chuẩn kết quả phân tích HPLC được thể hiện ở bảng 2.3. Kết quả bảng 3.6 cho thấy, cả 4 mẫu đậu nghiên cứu hàm lượng daidzein và genistein khá ít, đều dưới 10 µg/g. Như vậy, qua phân tích cho thấy isoflavone trong mầm hạt đậu Nho nhe của 4 mẫu đậu Nho nhe nghiên cứu đều rất thấp.
3.6. Hàm lượng lipit trong các mẫu đậu Nho nhe
Lipit là thành phần có nhiều trong cây đậu tương, đậu nành để sản xuất dầu ăn và hàm lượng lipit phụ thuộc vào loại cây trồng, thời gian và cách bảo quản. Trong nghiên cứu này, hạt khô của 8 mẫu đậu Nho nhe đã được xác định hàm lượng lipit có trong hạt. Kết quả bảng 3.7 cho thấy, hàm lượng lipit có trong hạt của 8 mẫu đậu Nho nhe dao động từ 0,68-0,95%. Trong đó, hàm lượng lipit cao nhất ở mẫu đậu Nho nhe NN18-LC (đạt 0,95%), tiếp theo là NN14-ĐB (đạt 0,73%) và thấp nhất là mẫu NN15-ML (đạt 0,64%).
Năm 2012, Nguyễn Ngọc Quất và cộng sự đã báo cáo hàm lượng lipit từ 10 giống đậu xanh trồng tại tỉnh Nghệ An và Hà Tĩnh dao động từ 0,46-1,26% [5]. Như vậy, hàm lượng lipit từ các mẫu đậu Nho nhe trong nghiên cứu này có
giá trị trung bình dao động từ 0,64-0,95% và khác so với lipit từ một số giống đậu xanh đã công bố.
Bảng 3.7. Hàm lượng lipit của các giống đậu Nho nhe
TT Mẫu đậu Nho nhe Hàm lượng lipit (%)
1 NN14-ĐB 0,73 2 NN15-ML 0,64 3 NN16-TP 0,65 4 NN17-QN 0,66 5 NN18-LC 0,95 6 NN19-TC 0,68 7 NN20-TC 0,69 8 NN21-TC 0,72
3.7. Đặc điểm của vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho nhe
Mẫu đậu Nho nhe NN18-LC thu tại Lai Châu và NN20-TC thu tại Sơn La được nhận diện dựa trên vùng gen ITS. Tiến hành tách DNA tổng số từ mầm
cây đậu Nho nhe được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose và đo quang phổ, kết quả DNA thu được đảm bảo chất lượng cho phản ứng nhân gen.
Vùng gen ITS từ cây đậu Nho nhe được phân lập bằng phản ứng PCR từ DNA hệ gen sử dụng cặp mồi đặc hiệu trong bảng 2.5. Sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 460 bp (Hình 3.12) ứng với vùng gen ITS từ cây đậu Nho nhe thu tại tỉnh Lai Châu và Sơn La.
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số
1: Vùng gen ITS từ đậu Nho nhe NN18-LC, 2: Vùng gen ITS từ đậu Nho nhe NN20-TC, M: DNA marker.
Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC được xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer có kích thước là 458 nucleotide (Hình 3.13).
Bằng phần mềm BLAST trong NCBI cho thấy, vùng gen ITS phân lập từ mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC ở Việt Nam có tỉ lệ tương đồng 100% so với trình tự vùng gen ITS của loài Vigna umbellata trên GenBank có
Hình 3.13. Trình tự vùng gen ITS của đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC
Như vậy, kết quả so sánh bằng BLAST trong NCBI đã khẳng định được trình tự đoạn DNA phân lập từ hai mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC là trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ loài đậu Nho nhe Vigna umbellata ở tỉnh Sơn La, Việt Nam (Hình 3.14).
Hình 3.14. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS
của mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI
Kết quả so sánh trình tự nucleotit của vùng gen ITS của hai mẫu đậu Nho nhe với trình tự vùng gen ITS mang mã số KX087818.1 được trình bày ở hình 3.15. So sánh trình tự vùng gen ITS của 2 mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và
NN20-TC, nhận thấy trình tự vùng gen ITS của 2 mẫu này có độ tương đồng
100% và không có sự khác nhau về trình tự nucleotide.
Hình 3.15. Trình tự nucleotit của vùng gen ITS từ mẫu đậu Nho nhe
NN18-LC và NN20-TC với loài mang mã số KX087818.1 trên GenBank Tiến hành phân tích mối quan hệ giữa các loài đậu thuộc chi Vigna dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS công bố trên GenBank bằng phần mềm
MegAlign, kết quả xác định được hệ số tương đồng, hệ số phân ly và sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các cây đậu Nho nhe ở Việt Nam với các loài thuộc chi
Vigna trên thế giới. Các trình tự vùng gen ITS sử dụng phân tích được thống kê
gồm 4 loài V. umbellata (KX087818.1), V. reflexopilosa (KX087791.1), V.
Glabrescens (KX087721.1), V. hirtella (KX087729.1) và 2 mẫu đậu Nho nhe
NN18-LC và NN20-TC. Kết quả cho thấy hệ số tương đồng từng cặp so sánh dao động từ 96,7-100%; hệ số phân ly dao động từ 0-3,1%. Hai trình tự vùng
gen ITS của mẫu NN18-LC và NN20-TC có hệ số tương đồng là 100%; và tương đồng 97,7% với loài đậu Nho nhe V. umbellata (Bảng 3.8).
Bảng 3.8. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng gen
ITS từ mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC với các loài trên GenBank
Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây đậu Nho nhe dựa trên trình tự vùng gen ITS và 4 loài trên GenBank và 2 loài NN18-LC và NN20-TC được thể hiện ở hình 3.16. Như vậy, 2 mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC trong nghiên cứu có tên khoa học là Vigna umbellata.
Hình 3.16. Sơ đồ cây phân loại dựa trên trình tự nucleotit vùng gen ITS
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Tám giống cây đậu Nho nhe NN14-ĐB, NN15-ML, NN16-TP, NN17-QN, NN18-LC, NN19-TC, NN20-TC và NN21-TC đều có chung đặc điểm giống nhau với 1 rễ cọc và các rễ phụ; Thân thảo, mọc đứng, có nhiều lông nhỏ ở trên thân; Lá có 3 chét, hình quả tim, có lông tơ nhám. Giải phẫu rễ các giống cây đậu Nho nhe gồm các phần: Biểu bì, mô mềm vỏ, mô cứng, libe và gỗ. Giải phẩu thân gồm: Bần, mô dày, đám mô cứng, mô mềm vỏ, gỗ, tầng phát sinh, libe, mô mềm ruột và lông che chở. Giải phẫu lá gồm biểu bì trên, mô giậu, mô xốp, biểu bì dưới, libe, gỗ, vòng mô cứng, mô mềm, mô dày và lông che chở.
Hàm lượng lipit và protein tan tổng số của 8 mẫu đậu Nho nhe lần lượt dao động từ 0,68-0,95% và 43,5-51,2%. Isoflavone trong mầm hạt đậu Nho nhe của 8 mẫu sau 3 ngày tuổi có chứa daidzein và genistein rất thấp dưới 10 µg/g. Trong mầm hạt đậu Nho nhe của 8 mẫu nghiên cứu đều có hoạt tính α-amylase và protease.
Vùng gen ITS từ 2 mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC đã được
phân lập và giải trình tự có độ dài 458 nucleotit và khẳng định 2 mẫu đậu Nho nhe NN18-LC và NN20-TC thuộc loài Vigna umbellata.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc điểm sinh học của giống đậu Nho nhe để cung cấp đầy đủ các thông tin về giống.
THÀNH TÍCH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Thái Thị Hòa, Đỗ Thị Kim Oanh, Kiều Thị Trà Giang, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Quân (2018), "Đặc điểm hình thái, giải phẫu, hóa sinh và mã vạch DNA của hai mẫu đậu nho nhe thu tại Yên Bái và Hà Giang", Tạp chí Khoa