3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử
Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được phân lập từ lá non dựa trên phương pháp của Shaghai và đồng tác giả (1984) [32]. 0,8 g lá cây tươi mỗi giống được nghiền trong nitơ lỏng sau đó bổ sung 6 ml đệm rửa (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH PO 0,4%; sorbitol 350 mM; H O) lắc đều và li tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, loại dịch để thu cặn (lặp lại thao tác này 1 lần). Bổ sung 700µl đệm chiết (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM, pH 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; H20) vào mỗi ống, đảo đều và ủ 30-60 phút ở 65°C từ 5-10 phút đảo nhẹ ống 1 lần, để ở nhiệt độ phòng 5 phút và li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch sang ống mới. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỉ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu; đảo nhẹ ống 2-3 lần và li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch pha trên sang ống mới. Bổ sung phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) với tỉ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu; đảo nhẹ ống 2-3 lần và li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch pha trên sang ống mới. Tủa DNA với isopropanol tỉ lệ 1:1 về thể tích, giữ -20°C trong 2 giờ và li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C thu tủa và rửa bằng 500µl ethanol 70%, sau đó li tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C và thu tủa, để khô ở 37C. Sau đó, tủa được hòa trong 30 μl TE và 0,25 μl RNase, và ủ 15 phút ở 37C.
Nhân bản vùng gen ITS bằng phản ứng PCR: Vùng gen ITS được nhân
bản với cặp mồi tương ứng (Bảng 2.5) trong phản ứng PCR có thành phần như trong bảng 2.6 và chương trình nhiệt bên dưới.
Bảng 2.5. Thông tin về cặp mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự (5′3′) Nhiệt độ
gắn mồi Sản phẩm dự kiến ITS-F ITS-R ATGCGATACTTGGTGTGAAT GACGCTTCTCCAGACTACAAT 54°C ~ 600 pb
Bảng 2.6. Thông tin về cặp mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu
Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)
2x PCR master mix solution - 10,0
Mồi xuôi 10 pmol/μl 1,0
Mồi ngược 10 pmol/ μl 1,0
H2O khử ion vô trùng - 7,0
Tổng thể tích 20,0
Chương trình phản ứng PCR: 94°C trong 3 phút (94°C: 30 giây, 54°C:
30 giây, 72°C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72°C trong 5 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 4°C. Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng khác nhau phụ thuộc vào cặp mồi sử dụng. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TAE 1X, thời gian chạy 45 phút, hiệu điện thế 110 V. Bản gel được nhuộm trong ethidium bromide khoảng 5-10 phút, soi dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm., quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV). Sản phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn của kit tinh sạch sản phẩm PCR của Norgen, Canada.
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi đi để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn DNA được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Trình tự nucleotide của đoạn DNA được phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như DNAstar, Bioedit, Mega6,... Trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch DNA sau khi phân tích sẽ được đăng ký trong ngân hàng cơ sở dữ liệu DNA của Việt Nam.
2.2.4. Phương pháp xử lý và phân tích kết quả
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để thống kê số liệu và phần mềm DNAStar, BioEdit, BLAST trong NCBI để phân tích hệ gen.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Ðặc điểm hình thái ngoài và giải phẫu của các giống đậu Nho nhe 3.1.1. Ðặc điểm hình thái ngoài của các giống đậu Nho nhe 3.1.1. Ðặc điểm hình thái ngoài của các giống đậu Nho nhe
Các giống đậu Nho nhe thu được tại các tỉnh thuộc miền núi phía Bắc gồm giống thu tại Điện Biên (NN14-ĐB), giống thu tại Mường Lầm - Sơn La (NN15-ML), giống thu tại thành phố Sơn La (NN16-TP), giống thu tại Quỳnh Nhai - Sơn La (NN17-QN), giống thu tại Lai Châu (NN18-LC), giống thu tại Thuận Châu - Sơn La (NN19-TC, NN20-TC, NN21-TC) được trồng tại vườn thí nghiệm của Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên để nghiên cứu hình thái ngoài. Kết quả mô tả hình thái ngoài của 8 giống như sau:
Hình thái rễ: 8 giống cây đậu Nho nhe: NN14-ĐB, NN15-ML, NN16-TP,
NN17-QN, NN18-LC, NN19-TC, NN20-TC và NN21-TC đều có chung đặc điểm giống nhau với 1 rễ cọc và các rễ phụ. Trên rễ phụ có nhiều nốt sần, nốt sần có vai trò cố định nitơ trong không khí. Rễ chịu hạn khá nhưng chịu úng kém (Hình 3.1).
Hình thái thân: 8 giống đậu Nho nhe đều là thân thảo, mọc đứng. Chiều
cao của thân phụ thuộc vào giống và cách trồng. Thân khi còn non có màu xanh lục, hoặc màu tím, sau đó chuyển dần sang xanh đậm. Các giống đều có nhiều lông nhỏ ở trên thân (Hình 3.2).
Hình thái lá: Đo, đếm xác định kích thước về chiều dài lá, số lượng lá
chét và kích thước lá chét được thực hiện theo phương pháp thông thường. Kết quả nhận thấy, 8 mẫu đậu Nho nhe có kích thước và chiều dài lá khá giống nhau. Lá có 3 chét, hình quả tim, có lông tơ nhám. Lá chét trung tâm có gân lá đối xứng và có cuống dài hơn so với lá chét hai bên. Lá chét 2 bên mọc đối diện và gân lá không đối xứng. Lá của 8 mẫu đậu Nho nhe đều có màu xanh đậm (Hình 3.3).
A B C
D E F
G H
Hình 3.1. Hình thái rễ của các giống đậu Nho nhe
A: NN14-ĐB; B: NN15-ML; C: NN16-TP; D: NN17-QN; E: NN18-LC; F: NN19-TC; G: NN20-TC; H: NN21-TC
A B C
D E F
G H
Hình 3.2. Hình thái thân của các giống đậu Nho nhe
E: NN18-LC; F: NN19-TC; G: NN20-TC; H: NN21-TC
A B C
D E F
G H
Hình 3.3. Hình thái lá của các giống đậu Nho nhe
E: NN18-LC; F: NN19-TC; G: NN20-TC; H: NN21-TC
A B C
D E F
Hình 3.4. Hình thái hoa các giống đậu Nho nhe A: NN14-ĐB; B: NN15-ML; C: NN16-TP; D: NN17-QN; E: NN18-LC; F: NN19-TC; G: NN20-TC; H: NN21-TC A A1 B B1 C C1 D D1 E E1 F F1 G G1 H H1
Hình 3.5. Hình thái ngoài quả các giống đậu Nho nhe
A-A1: NN14-ĐB; B-B1: NN15-ML; C-C1: NN16-TP; D-D1: NN17-QN; E-E1: NN18-LC; F-F1: NN19-TC; G-G1: NN20-TC; H-H1: NN21-TC
Hình thái hoa: Đo, đếm số lượng và kích thước nụ hoa, kích thước các bộ
phận của hoa bằng thước kẹp panme. Hoa đậu Nho nhe đều có màu vàng, hoa tự nở ở nách lá (Hình 3.4).
Hình thái quả: Quả đậu Nho nhe khi non thường có màu xanh. Khi chín
quả chuyển sang màu nâu, chiều dài của quả khoảng 7-9 cm (Hình 3.5).
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái hạt của các giống đậu Nho nhe
TT Mẫu Hình dạng hạt Hình dạng vỏ hạt Màu vỏ hạt Màu rốn hạt KL1000 hạt (g)
1 NN14-ĐB Ô van Trơn bóng Vàng nâu Trắng 86,5
2 NN15-ML Ô van Rạn vỏ, có
vân đen Nâu đen Trắng 50,0
3 NN16-TP Ô van, dẹt Trơn bóng, rạn vỏ,có vân đen Vàng nâu, nâu đen, nâu đỏ Trắng 64,1 4 NN17-QN Ô van, dẹt Trơn bóng, có vân đen Vàng nhạt, nâu đỏ, xám có vân đen Trắng 51,7 5 NN18-LC Ô van, dẹt Trơn bóng, rạn vỏ, có vân đen Vàng nhạt, vàng nâu, đỏ, xám có vân Trắng 58,7 6 NN19-TC Dài, dẹt Trơn bóng, rạn vỏ có vân đen Xám vân đen, vàng nhạt/nâu, đen Trắng 52,5 7 NN20-TC Ô van Trơn bóng, rạn vỏ, có vân đen Xám/nâu/vàng có vân đen/nâu Trắng xám 67,1 8 NN21-TC Ô van, dẹt Trơn bóng, rạn vỏ, có vân đen Xám/nâu/vàng nhạt/đỏ có vân đen Trắng 45,1
Hình dạng hạt: Hình thái và khối lượng hạt là một trong những đặc tính
được quan tâm trong công tác chọn giống. Kết quả phân tích đặc điểm hình thái của các giống đậu Nho nhe thu tại Điện Biên, Lai Châu, Sơn La dựa trên các
tính trạng hình dạng hạt, màu sắc hạt, màu sắc rốn hạt và khối lượng hạt. Các giống đậu Nho nhe có hình ovan, dẹt hoặc dài; màu sắc của vỏ hạt và rốn hạt khác nhau tùy thuộc vào từng giống. Khối lượng 1000 hạt của 8 giống đậu nho nhe được thể hiện dao động từ 45-86,5 g (Hình 3.6 và Bảng 3.1).
A B C
D E F
G H
A: NN14-ĐB; B: NN15-ML; C: NN16-TP; D: NN17-QN; E: NN18-LC; F: NN19-TC; G: NN20-TC; H: NN21-TC
3.1.2 Hình thái giải phẫu của các giống đậu Nho nhe 3.1.2.1. Hình thái giải phẫu của rễ 3.1.2.1. Hình thái giải phẫu của rễ
Cấu tạo giải phẫu rễ của 8 giống đậu đỗ Nho nhe thu tại các tỉnh Điện Biên, Lai Châu, Sơn La có các phần giống nhau, gồm: Ngoài cùng là lớp biểu bì (1) đã hóa bần dày khoảng 1-2 lớp tế bào, có hình chữ nhật, vách hóa bần, bắt màu xanh, là những tế bào rỗng, không chứa nội chất. Các tế bào xếp đều đặn và không chừa ra các khoảng gian bào. Bần không thấm nước có chức năng bảo vệ. Dưới bần là mô mềm vỏ (2) gồm 4-5 lớp tế bào có hình hơi tròn, xếp sít nhau, có kích thước không đều nhau. Mô cứng (3): Gồm một số các tế bào bắt màu xanh xếp thành từng đám tế bào đảm nhiệm chức năng cơ học. Libe (4): Gồm những tế bào sống, có kích thước nhỏ, xếp liên tục tạo thành vòng xung quanh bó libe. Gỗ (5): Gồm các mạch gỗ lớn xếp thành dải, chiếm hầu hết thể tích phần trụ (Hình 3.7).
Hình 3.7. Hình thái giải phẫu rễ các giống cây đậu Nho nhe
3.1.2.2 Hình thái giải phẫu của thân
Hình thái giải phẫu của thân cây đậu Nho nhe từ các giống gồm: (1) Lớp biểu bì phủ ngoài thân là một lớp tế bào dày gồm những tế bào hình trứng xếp xít nhau uốn lượn theo thân tạo thành vòng ngoài cùng, biểu bì đã hóa bần. (2) Mô dày gồm 1- 2 lớp tế bào sống, vách dày bắt màu hồng, có chức năng nâng đỡ. (3) Mô cứng gồm những tế bào có vách dày, xếp liền nhau tạo thành vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học. (4) Mô mềm vỏ gồm 2-3 lớp tế bào không có diệp lục, gồm những tế bào hình đa giác, màng mỏng, có kích thước lớn, tương đối đồng đều, xếp sít nhau để chừa ra các khoảng gian bào nhỏ. (5) Gỗ gồm 5-6 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, xếp thành vòng tròn liên tục. (6) Tầng phát sinh: Gồm các tế bào sống, có hình chữ nhật hơi dài. Các tế bào của tầng sinh trụ phân chia theo hướng tiếp tuyến trong cho gỗ thứ cấp và phân chia theo hướng tiếp tuyến ngoài cho libe thứ cấp. (7) Libe gồm những tế bào hình đa giác, xếp sít nhau, có màng mỏng. Các tế bào libe phân hóa hướng tâm. (8) Mô mềm ruột gồm các tế bào tròn cạnh, có kích thước khác nhau chiếm phần lớn diện tích. (9) Lông che chở có chức năng bảo vệ thân (Hình 3.8).
Hình 3.8. Hình thái giải phẫu thân các giống đậu Nho nhe
1. Bần; 2. Mô dày; 3. Ðám mô cứng; 4. Mô mềm vỏ; 5. Gỗ; 6. Tầng phát sinh; 7. Libe; 8. Mô mềm ruột; 9. Lông che chở.
3.1.2.3. Hình thái giải phẫu của lá
Kết quả giải phẫu lá nhận thấy, các giống đậu Nho nhe thu tại Điện Biên, Lai Châu, Sơn La gồm các lớp: Biểu bì, mô dày, mô mềm vỏ, mô cứng, libe sơ cấp và gỗ sơ cấp.
(1) Biểu bì là lớp ngoài cùng, được cấu tạo gồm những tế bào hình chữ nhật, xếp xít nhau, không có lục lạp, có chức năng bảo vệ; phía ngoài biểu bì có lông. (2) Mô giậu gồm 2-3 lớp tế bào dài, xếp thẳng vuông góc với bề mặt cơ quan, nằm tiếp giáp ngay dưới biểu bì trên, chứa nhiều lục lạp. (3) Mô xốp (còn gọi là mô khuyết) nằm ngay dưới mô giậu và trên biểu bì dưới. (4) Biểu bì dưới có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào bên trong. Lớp mô dày gồm 2-3 lớp tế bào sống, có hình đa giác, vách dày, bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm); các tế bào nằm sát dưới biểu bì chuyên hóa với chức năng cơ học. (5) Lớp libe sơ cấp gồm các tế bào sống (bắt màu hồng của thuốc nhuộm cacmin), có hình đa giác, nhỏ, xếp xít nhau tạo thành một vòng liên tục. (6) Gỗ sơ cấp gồm 8-9 lớp tế bào chết, bắt màu xanh, có kích thước khác nhau, nằm phía trong libe tạo nên bó xếp chồng. (7) Lớp mô cứng gồm những tế bào có vách dày, xếp liền nhau tạo thành vòng, đảm nhiệm chức năng cơ học của lá. (8) Lớp mô mềm vỏ gồm 10-11 lớp tế bào có kích thước không đồng đều chiếm phần lớn diện tích. (9) Mô dày gồm 2-3 lớp tế bào sống, có hình đa giác, vách dày, bằng xenlulose (bắt màu đỏ đậm). (10) Lông che chở có chức năng bảo vệ lá (Hình 3.9).
Hình 3.9. Hình thái giải phẫu lá của các giống đậu Nho nhe
1. Biểu bì trên; 2. Mô giậu; 3. Mô xốp; 4. Biểu bì dưới; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Vòng mô cứng; 8. Mô mềm; 9. Mô dày; 10. Lông che chở.
3.2. Hoạt tính α- amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe
α-amylase là enzyme phân giải tinh bột thành đường glucose. Khi hạt nảy mầm α-amylase được tổng hợp và hoạt động mạnh, giúp quá trình phân giải tinh bột diễn ra mạnh mẽ để tổng hợp các chất hữu cơ cho sự hình thành cây non, làm cho hàm lượng đường tăng. Đường tạo thành có vai trò làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, từ đó làm tăng tính chống chịu của thực vật với các yếu tố cực đoan từ môi trường, giúp cây non phát triển bình thường.
Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe từ 8 giống sau 01 ngày được định tính trên đĩa thạch có chứa cơ chất 1,0% tinh bột. Kết quả hình 3.10 nhận thấy, trên đĩa thạch xuất hiện các vòng phân giải cơ chất màu trắng sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm lugol. Đường kính vòng phân giải cơ chất của α-amylase từ các mẫu đậu Nho nhe dao động từ 1,4-1,7 cm (Bảng 3.2). Như vậy, các giống đậu Nho nhe trong nghiên cứu khi nảy mầm đều có hoạt tính α-amylase.
TT Mẫu đậu Nho nhe Đường kính vòng phân giải cơ chất (cm) 1 NN14-ĐB 1,5 2 NN15-ML 1,7 3 NN16-TP 1,7 4 NN17-QN 1,5 5 NN18-LC 1,5 6 NN19-TC 1,4 7 NN20TC 1,5 8 NN21-TC 1,6
α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe của các mẫu NN14-ĐB, NN16-TP, NN20-TC và NN21-TC được định lượng bằng phương pháp đường khử theo Miller. Kết quả định lượng nhận thấy, hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe của các mẫu NN14-ĐB, NN16-TP, NN20-TC và NN21-TC lần lượt đạt 1,08; 0,21; 0,74 và 0,81 U/mg protein (Bảng 3.3).
Hình 3.10. Định tính α- amylase trên đĩa thạch của các giống đậu Nho nhe
Bảng 3.3. Hoạt tính α-amylase của các giống đậu Nho nhe
1 NN14-ĐB 1,08
2 NN16-TP 0,21
3 NN20-TC 0,74
4 NN21-TC 0,81
Hoạt tính α-amylase từ mầm hạt đậu Nho nhe trong nghiên cứu này được so sánh với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Nguyễn Văn Tuân (2007) [7] nhận thấy, hoạt tính α-amylase từ mầm đậu Nho nhe trong nghiên cứu này cao hơn so với các mẫu đậu xanh thu tại tỉnh Hòa Bình, Lai Châu, Thái Nguyên, Cao Bằng sau 5 ngày (hoạt tính dao động từ 0,573- 0,941 U/mg protein).
3.3. Hoạt tính enzyme protease từ mầm hạt đậu Nho nhe
Protease là enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình nảy mầm của hạt, sự phát triển của cây non và có liên quan đến khả năng chịu mất nước của