3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.5. Xác định hàm lượng lipit
Dựa vào tính chất hòa tan của dung môi hữu cơ để chiết lipit, dung môi hữu cơ sử dụng là petroleum ether.
Cách tiến hành: Mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi, bóc vỏ, bỏ phôi mầm, nghiền mịn. Cân 0,05g mẫu cho vào ống eppendort 2,0ml. Sau đó, bổ sung 1,5 ml petroleum ether, lắc nhẹ 10 phút để qua đêm ở 4°C, li tâm 15 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút ở 4°C, bỏ dịch (lặp lại 3 lần). Sấy khô mẫu còn lại ở ống eppendort ở 70°C đến khối lượng không đổi. Hàm lượng lipit được tính bằng hiệu của khối lượng mẫu trước và sau khi chiết theo công thức sau:
Hàm lượng lipit (%): = (A B) 100%/A Trong đó: A: Khối lượng mẫu trước khi chiết; B: Khối lượng mẫu sau khi chiết.
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng isoflavon
Hàm lượng isoflavone từ mầm đậu Nho nhe được xác định theo phương pháp HPLC theo Chen và đồng tác giả (2010) [15]:
Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Lượng mẫu đem xử lý sơ bộ khoảng 50-100g, được nghiền kỹ bằng máy nghiền mẫu tự động hoặc cầm tay và trộn đều trước khi đem cân.
Chuẩn bị mẫu thử: Cân 1-2g mẫu vào ống li tâm 50ml, thêm 35 ml dung dịch Methanol : HCl 4N (8:2). Thủy phân trong 80°C/1 giờ, để nguội và li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn lấy phần dịch phía trên. Thêm 10 ml dịch chiết vào phần cặn, lắc đều trong 1 phút rồi đem li tâm, gộp phần dịch trong
cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, phân tích trên HPLC.
Điều kiện chạy máy: (1) Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm); (2) Nhiệt độ cột: 40°C, tốc độ dòng 1,0ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20µl; (3) Detector PDA quét phổ từ 200-400nm, định lượng ở bước sóng 260nm; (4) Pha động chạy theo chương trình gradient nồng độ theo bảng 2.4.
Tính toán kết quả: Căn cứ vào đường chuẩn tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau:
X (mg/100g) = (V Cm × k)/(m x 10) Trong đó: (V): Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy (ml).
(Cm): Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn (g/ml).
(m): Khối lượng của mẫu phân tích (g).
(X): Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử (g/100g). (k): Hệ số pha loãng mẫu.
Bảng 2.4. Chương trình gradient nồng độ của pha động Thời gian (phút) Thành phần pha động (%)
Methanol Phosphoric acid 0,1%
0 10 90 1 10 90 3 45 55 21 60 40 23 10 90 25 10 90