Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu máu
Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy mẫu máu cho phân tích gen NAT2 vào ngày điều trị thứ 10 -14. Mỗi bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống có chất chống đông EDTA ghi đầy đủ thông tin gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Mẫu được vận chuyển bằng hộp giữ lạnh đựng mẫu chuyên dụng về phòng thí nghiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội bảo quản ở -300
C cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo.
Tách chiết, kiểm tra và định lƣợng ADN
ADN được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng kit E.Z.N.A blood DNA Mini (Mỹ). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng máy đo Nano Photometer-implen NP80: đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). DNA được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. Chất lượng DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
Gen NAT2 sẽ được xác định các SNP (NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7) bằng phương pháp PCR- giải trình tự gen. Đầu tiên, DNA tổng số được sử dụng để nhân dòng đoạn gen NAT2 có độ dài 1093 bp sử dụng cặp mồi 5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’ [56]. Các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần tối ƣu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2
Thành phần Nồng độ Thể tích 1 phản ứng (25 µL)
Nước khử ion 10
Master Mix Kapa2G Robust Hotstart DNA polymerase
1X 12.5
Mồi xuôi 10 µM 0,3 µM 0,75
Mồi ngược 10 µM 0,3 µM 0,75
DNA 1
Tối ưu phản ứng PCR: Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA đã được tiến hành biến tính với 95 oC trong 3 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ (95 o
C trong 15s, 58 oC trong 15s, 72oC trong 1 phút), giai đoạn kết thúc ở 72oC trong 10 giây và bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang chuẩn O Gene Ruler Ladder DNA marker/Massruler Express Forward DNA Ladder Mix để xác định kích thước sản phẩm.
Xác định kiểu gen NAT2 bằng phƣơng pháp giải trình tự
20 µL sản phẩm PCR đã được kiểm tra trên gel agarose sẽ được gửi đến hãng First base (Malaysia ) để giải trình tự bằng cách sử dụng cùng 1 mồi (5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’) cho cả đoạn gen NAT2. Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân. Các đọc như sau: mỗi nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp tử.