- Bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS
- Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Cỡ mẫu
Nghiên cứu tiến cứu kết hợp hồi cứu, sử dụng phương pháp lấy mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn theo tiêu chuẩn mục 2.2.1 và đối tượng tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu. Thu nhận mẫu từ tháng 3/2017 đến tháng 6/2018 cho tới khi cỡ mẫu đạt 125.
2.3.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm
Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy đờm (3-5ml) theo đúng hướng dẫn của Chương trình chống lao quốc gia (2017) để nuôi cấy và theo dõi kết quả nuôi cấy và định danh. Kết quả định danh là MTB thì sẽ được gửi mẫu đến Khoa Vi sinh và Labo tham chiếu Quốc gia của Bệnh viện Phổi trung ương để lưu mẫu tại -700C chờ làm kháng sinh đồ đặc và lỏng.
Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện
2.3.3. Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT
Nguyên lý: Một lớp huỳnh quang được đưa vào bên trong lớp silicon nằm ở đáy ống có đường kính 16x100 mm. Chất huỳnh quang nhạy với sự hiện diện của Oxy hòa tan trong môi trường. Nồng độ oxy ban đầu có trong ống làm bất hoạt huỳnh quang. Sau đó khi vi sinh vật hô hấp tiêu thụ oxy làm giảm lượng oxy dẫn đến sự phát quang. Ống môi trường được đưa vào hệ thống BACTEC MGIT 960/320 được ủ liên tục ở 370C và tín hiệu huỳnh quang được giám sát 60 phút/lần. Máy báo dương bằng tín hiệu đèn và âm thanh khi trong ống chứa từ khoảng 105
- 106 CFU/mL. Sau 42-56 ngày nếu không có tín hiệu huỳnh quang được thu nhận thì máy sẽ báo âm tính.
Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện Phổi Hà Nội Mẫu đờm nuôi cấy, định danh MTB tại Bệnh viện K74 Gữi mẫu MGIT dương
Nuôi cấy, định danh và phân lập làm kháng sinh đồ tại khoa Vi sinh và Labo Lao chuẩn Quốc Gia - Bệnh viện Phổi Trung
Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960
Các bƣớc tiến hành: 3-5 ml đờm có nhày mủ được thu thập trong ống falcon 50ml. Mẫu đờm của bệnh nhân được khử tạp bằng dung dịch NaCl-NaOH với thể tích pha là 1:1, voltex, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút sau đó thêm dung dịch NaCl-NaOH cho đến khi đầy 40 ml rồi ly tâm 3000 rpm/15 phút ở 100C, gạn dịch nổi và bổ sung 0,5 ml dung dịch đệm nuôi cấy để thu huyền dịch. Huyền dịch sau đó được đưa vào ống MGIT đã bổ sung thêm các yếu tố tăng trưởng (PANTA supplement), kháng sinh, kháng nấm và nuôi cấy trong hệ thống BACTEC MGIT 960/320. Kết quả cấy được theo dõi trong vòng 42 ngày, mẫu bệnh phẩm sẽ được máy tự động ghi nhận kết quả. Cách nhận định kết quả được tóm tắt ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT
Máy báo Nhuộm soi Định danh Kết quả
Dương Vi khuẩn khác, nấm Ngoại nhiễm
AFB cuộn thừng, AFB Dương tính M.tuberculosis
complex
Âm tính NTM*
AFB vụn Âm tính NTM*
Âm tính Không thấy cặn vụn Âm tính
Có cặn vụn hoặc nhuộm soi dương tính làm theo quy trình ống dương
2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một
Việc thực hiện kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một được thực hiện bằng 02 phương pháp: kháng sinh đồ trên môi trường lỏng được thực hiện cho Pyrazinamid (PZA), kháng sinh đồ trên môi trường đặc được thực hiện cho 4 thuốc chống lao còn lại là Rifampicin (RMP), Isoniazid (INH), Ethambutol (EMB), Streptomycin (SM). Quá trình làm kháng sinh đồ được thực hiện trong phòng an toàn sinh học có áp lực âm và tủ an toàn sinh học cấp độ II, theo quy trình chuẩn của Labo Lao chuẩn quốc gia tại Bệnh viện Phổi Trung ương.
2.3.4.1. Phương pháp xác định tính kháng Pyrazinamide (PZA) trên môi trường lỏng
Nguyên lý: Hệ thống BACTEC MGIT 960 được dùng làm thử nghiệm kháng sinh đồ PZA. Dựa trên chỉ số growth unit (GU), hệ thống tự động so sánh lượng vi khuẩn mọc ở ống chứa thuốc kháng sinh với ống chứng không chứa thuốc kháng sinh, máy tự động phân tích kết quả. Chủng vi khuẩn thử nghiệm được pha theo tỷ lệ quy định, cấy vào môi trường lỏng MGIT không có và có PZA và đưa vào hệ thống nuôi cấy. Hệ thống sẽ giám sát liên tục sự phát phát quang của ống cấy dựa trên đơn vị sinh trưởng GU. Kết quả kháng sinh đồ được báo cáo trong vòng 4- 21 ngày khi ống chứng đạt 400 GU, dựa trên so sánh định lượng sự phát triển của vi khuẩn lao trong ống chứng và ống có thuốc PZA. Ống có thuốc PZA GU < 100 là nhạy cảm; GU > 100 là kháng thuốc. Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày với cùng lô hóa chất được kiểm tra chất lượng bằng chủng chuẩn H37RV 100 và được thực hiện như chủng thử nghiệm.
Các bƣớc tiến hành
Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị 02 ống (ống chứng và ống thử nghiệm) chứa MGIT960 PZA có bổ sung 0,8ml yếu tố sinh trưởng, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và ngày xét nghiệm lên ống. Pha PZA 8000µg/ml trong 2.5 ml nước cất vô trùng. Lấy 100 µl PZA bổ sung vào ống MGIT thử nghiệm.
Chuẩn bị chủng làm kháng sinh đồ: Các chủng làm kháng sinh đồ được kiểm tra là chủng thuần. Huyền dịch vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách gặt chủng cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất, voltex trong 2-3 phút để chủng được hòa tan hoàn toàn, ủ 15 phút sau đó thêm nước cất trộn đều, điều chỉnh huyền dịch có độ đục hơn chuẩn Mac Farland 1.0. Sau 20 phút, chuyển phần
nước nổi sang ống vô trùng khác. Thêm nước cất, điều chỉnh huyền dịch có độ đục tương đương độ đục chuẩn Mc Farland 0.5. Pha tiếp huyền dịch với nước cất tỷ lệ 1:5, dùng huyền dịch này làm kháng sinh đồ. Lấy 1ml huyền dịch đã pha loãng 1:5 ở bước trên tiếp tục pha loãng với nước cất tỷ lệ 1:10 để được huyền dịch cấy vào ống MGIT960 PZA làm ống chứng GC.
Cấy huyền dịch vi khuẩn vào môi trường kháng sinh đồ: Dùng Pipet tự động hút 0,5ml huyền dịch chuẩn bị cho ống GC vào ống chứng GC. Dùng Pipet tự động húy 0,5ml huyền dịch pha loãng tỷ lệ 1:5 vào ống thử nghiệm PZA.Vặn chặt nắp mỗi ống và đảo ngược ống 3-4 lần để đồng nhất dung dịch. Xếp 2 ống vào giá code AST theo đúng thứ tự: GC-PZA. Đưa giá code AST vào máy BACTEC MGIT960 và ghi các thông tin vào sổ kháng sinh đồ.
Đọc kết quả kháng sinh đồ: Máy báo kết quả kháng sinh đồ tại thời điểm ống chứng GC đạt 400GU trong vòng 4-21 ngày. Ngưỡng kháng là 100GU. Kết quả kháng sinh đồ có thể được thông báo một trong ba trường hợp:
+ Kết quả nhạy (S): ống thử nghiệm PZA có mức GU < 100 + Kết quả kháng (R): ống thử nghiệm PZA có mức GU > 100
+ Kết quả không kết luận được (X) báo lỗi: ống thử nghiệm GU >400 và thời gian máy báo < 4 ngày có thể do pha huyền dịch đặc hoặc chủng nhiễm trùng; lỗi GU<200 có thể do một số chủng kháng thuốc đặc hiệu mọc chậm hoặc huyền dịch vi khuẩn quá loãng. Trong trường hợp này kiểm tra lại các bước và thực hiện lại kháng sinh đồ.
2.3.4.2. Phương pháp xác định tính kháng INH; RMP; SM; EMB trên môi trường đặc
Nguyên lý phƣơng pháp kháng sinh đồ tỷ lệ: Xác định tỷ lệ phần trăm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn lao mọc trên môi trường có chứa các loại thuốc chống lao ở nồng độ tối thiểu so với số vi khuẩn lao mọc trên môi trường đối chứng không chứa thuốc. Xác định sự kháng của vi khuẩn lao với từng loại thuốc bằng cách so sánh tỷ lệ trên với ngưỡng kháng. Nếu trên hoặc bằng ngưỡng là vi khuẩn kháng; dưới ngưỡng là vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc chống lao được trình bày ở bảng 2.2. Mỗi mẻ kháng sinh đồ trong ngày được làm cùng 03 chủng kiểm tra, cách thức làm giống như chủng thử nghiệm: Chủng chuẩn H37RV 100; chủng chứng kháng RS (kháng RMP và SM), chủng chứng kháng HE (INH và EMB).
Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngƣỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1 trên môi trƣờng đặc
Tên thuốc Nồng độ thuốc µg/ml Ngƣỡng kháng (%)
Isoniazid 0.2 1
Streptomycin 4.0 1
Rifampicin 49.0 1
Ethambutol 2.0 1
Các bƣớc tiến hành
Chuẩn bị môi trường: Chuẩn bị dung dịch Malachite green 2%, dung dịch LJ cơ bản, dung dịch trứng. Ở bảng 2.3, thuốc dạng bột được tính toán để pha trong nước cất vô trùng hoặc trong propylene tùy loại thuốc tạo thành dung dịch thuốc (1). Sau đó dung dịch thuốc (1) sẽ được pha tiếp với nước cất vô trùng để tạo thành những dung dịch có nồng độ thấp hơn rồi bổ sung vào môi trường LJ với thể tích phù hợp để đạt được nồng độ thuốc cuối cùng trong môi trường là 0,2 µg/ml cho INH; 40 µg/ml cho RMP; 4 µg/ml cho SM; 2 µg/ml cho EMB, 500 µg/ml cho PNB (Para nitrobenzoic acid) (ống đối chứng kiểm tra chủng xác định MTB).
Bảng 2.3: Hƣớng dẫn pha dung dịch thuốc (1)
Số mg thuốc mỗi loại tính theo độ tinh khiết
Hòa tan trong Dung dịch thuốc (1)
10 ml nước cất vô trùng Dung dịch INH (1) 2 ml dung môi Propylen
8 ml nước cất vô trùng
Dung dịch RMP (1)
10 ml nước cất vô trùng Dung dịch SM (1) 10 ml nước cất vô trùng Dung dịch EMB (1) 20 ml dung môi
Propylen
Dung dịch PNB (1)
Mỗi chủng thử nghiệm chuẩn bị: 04 ống môi trường LJ (2 ống ghi 10-2; 2 ống ghi 10-4); 04 ống môi trường LJ có chứa kháng sinh (INH, RMP, SM, EMB) và ống PNB. Ghi rõ các thông tin ký hiệu chủng, ngày thực hiện trên các ống.
Các chủng làm kháng sinh đồ được kiểm tra là chủng thuần đã được định danh; chủng nguyên thủy 3-4 tuần tuổi có nhiều hơn 5 khuẩn lạc; chủng cấy truyền 2 tuần tuổi.
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: Dùng ăng nhựa lấy vi khuẩn lao từ ống nuôi cấy cho vào ống có bi thủy tinh vô trùng và vài giọt nước cất. Voltex trong 2- 3 phút để chủng được hòa tan hoàn toàn. Chờ 15 phút. Thêm 2-4 ml nước cất vô trùng trộn đều để 15 phút. Dùng pipet vô trùng hút huyền dịch phía trên nhỏ dần vào ống chứa 10ml nước cất vô trùng, trộn đều, điều chỉnh huyền dịch độ đục tương đương Mac Farland 1.0. Ta được huyền dịch nồng độ 100
. Pha 100 µl huyền dịch 100 và ống chứa 99ml nước cất vô trùng, trộn đều được nồng độ 10-2, tiếp tục pha loãng trong nước cất để thu được nồng độ 10-4
. Huyền dịch 10-2 và 10-4 được sử dụng để làm kháng sinh đồ
Cấy chủng làm kháng sinh đồ: Dùng pipet vô trùng cấy vào ống môi trường có kháng sinh 0,1 ml huyền dịch vi khuẩn 10-4, nhẹ nhàng láng đều huyền dịch trên ống môi trường chứa kháng sinh. Hai ống LJ không chứa kháng sinh cấy huyền dịch vi khuẩn 10-4; 2 ống LJ không chứa kháng sinh khác cấy huyền dịch vi khuẩn 10-2. Sau đó, vặn lỏng nắp ống môi trường, đặt ống cấy lên khay, mặt môi trường quay lên trên, đặt khay vào tủ ấm 370
C. Kiểm tra ngoại nhiễm sau khi ủ ấm 24 giờ, 72 giờ, 1 tuần và vặn nắp ống khi mặt môi trường đã khô và tiếp tục cho vào tủ ấm.
Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc
Đọc kết quả kháng sinh đồ: Đánh giá kết quả ở 2 thời điểm là sau 28 ngày và 42 ngày nuôi cấy. Chủng chuẩn H37RV nhạy với các thuốc kháng lao; Chủng chứng kháng RS: kháng với Rifampicin và Streptomycin; Chủng chứng kháng HE: Kháng với Isoniazid và Ethamtanol; Các ống môi trường LJ 10-2 phải có số khuẩn lạc > 200 khuẩn lạc; Các ống môi trường LJ 10-4 phải có khuẩn lạc; Ống PNB không có khuẩn lạc, nếu mẫu nào có khuẩn lạc thì cần phải kiểm tra lại định danh chủng thử nghiệm.
Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc: Đánh giá trên tất cả 9 ống môi trường cụ thể như sau:
Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc
Đặc điểm Kết quả
Không thấy khuẩn lạc Âm tính
< 20 khuẩn lạc Dương tính: ghi cụ thể số khuẩn lạc 20 - 100 khuẩn lạc Dương tính: 1+
100 - 200 khuẩn lạc Dương tính: 2+ 200 - 500 khuẩn lạc Dương tính: 3+ >500 khuẩn lạc Dương tính: 4+
Nhiễm trùng hoặc nấm Ngoại nhiễm
Nhận định kết quả kháng thuốc: So sánh số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ có thuốc và ống môi trường không có thuốc LJ 10-4. Tỷ lệ 1% được gọi là ngưỡng kháng.
Tuỳ thuộc kết quả so sánh để đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao theo các trường hợp như bảng 2.5:
Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Kết qủa vi khuẩn mọc trên ống thuốc Ngày thứ 28 Ngày thứ 42 Kết luận tính kháng
Khuẩn lạc không mọc trên môi trường chứa thuốc
Kết quả sơ bộ: nhạy cảm
Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm
Tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc lớn hơn hoặc bằng ngưỡng kháng Kháng Trả kết quả Kháng Tỷ lệ phần trăm số khuẩn lạc nhỏ hơn ngưỡng kháng Kết quả chưa rõ ràng
Ủ ấm tiếp Nhạy cảm Nhạy cảm
Làm lại kháng sinh đồ sớm nhất có thể trong các trường hợp: vi khuẩn không mọc trên ống chứng; số lượng khuẩn lạc trên ống môi trường LJ 10-2 < 200 khuẩn lạc; tỷ lệ kháng xấp xỉ ngưỡng kháng; ngoại nhiễm. Các trường hợp ngoại nhiễm hoặc lẫn vi khuẩn ngoài lao sẽ được phát hiện trong khoảng thời gian một tuần sau khi thực hiện cấy kháng sinh đồ.
2.3.5. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid
Thu thập, vận chuyển và bảo quản mẫu máu
Những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đáp ứng 5 tiêu chuẩn đầu tiên trong mục 2.2.1 sẽ được lấy mẫu máu cho phân tích gen NAT2 vào ngày điều trị thứ 10 -14. Mỗi bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống có chất chống đông EDTA ghi đầy đủ thông tin gồm mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Mẫu được vận chuyển bằng hộp giữ lạnh đựng mẫu chuyên dụng về phòng thí nghiệm Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội bảo quản ở -300
C cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo.
Tách chiết, kiểm tra và định lƣợng ADN
ADN được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng kit E.Z.N.A blood DNA Mini (Mỹ). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng máy đo Nano Photometer-implen NP80: đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). DNA được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. Chất lượng DNA còn được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%.
Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR
Gen NAT2 sẽ được xác định các SNP (NAT2*5, NAT2*6, NAT2*7) bằng phương pháp PCR- giải trình tự gen. Đầu tiên, DNA tổng số được sử dụng để nhân dòng đoạn gen NAT2 có độ dài 1093 bp sử dụng cặp mồi 5'-GGA ACA AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3’ [56]. Các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần tối ƣu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2
Thành phần Nồng độ Thể tích 1 phản ứng (25 µL)
Nước khử ion 10
Master Mix Kapa2G Robust Hotstart DNA polymerase
1X 12.5
Mồi xuôi 10 µM 0,3 µM 0,75
Mồi ngược 10 µM 0,3 µM 0,75
DNA 1
Tối ưu phản ứng PCR: Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA đã được tiến hành biến tính với 95 oC trong 3 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ (95 o
C trong 15s, 58 oC trong 15s, 72oC trong 1 phút), giai đoạn kết thúc ở 72oC trong 10 giây và bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang