1. Môi trường nuôi cấy
1.7.2. Thử nghiệm vô trùng
Phương pháp: Cấy trực tiếp trên môi trường Thioglycolate/30-35oC và Soybean/20-25oC. Theo d i sau 14 ngày đọc kết quả.
Tiêu chuẩn: Thử nghiệm đạt yêu cầu khi không có dấu hiệu phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi [5].
1.7.3. Kiể tra độ sống
Phương pháp: Nuôi cấy tế bào trên MT MEM10%FBS Kiểm tra độ sống (viability) và đếm số lượng tế bào sống trên kính hiển vi nhằm xác định tỷ lệ tế bào sống sau khi nuôi cấy và cất giữ tế bào (MCB và WCB).
Tiêu chuẩn: Lượng tế bào sống ≥90% so với khi cất giữ (nồng độ 2x106 tb/ml/ống).
1.7.4 nh đồng nhất giữa các ống tế bào
Đảm bảo độ tin cậy và ổn định trong quy trình sản xuất vắc xin và sản xuất WC sau này, thì t nh đồng nhất giữa các ống tế bào của MCB, WCB rất quan trọng vì nếu không các WCB sản xuất từ MC cũng như các loạt sản xuất vắcxin trên tế bào sẽ không ổn định.
T nh đồng nhất giữa các ống tế bào được thể hiện trên kết quả kiểm tra độ sống và đặc tính phát triển hình thái, độ sống, thời gian nhân đôi tế bào) với số lượng ống tế bào lấy ngẫu nhiên trong giai đoạn đầu-giữa-cuối trong quá trình chia tuýp khi cất và sau khi cất đông tế bào trong nitơ lỏng).
Phương pháp: Kiểm tra độ sống ít nhất 6 ống tế bào ngẫu nhiên và so sánh độ đồng đều về độ sống giữa các ống tế bào, đặc tính phát triển và tính chất nuôi cấy các ống tế bào tại mỗi thời điểm đầu-giữa-cuối qui trình phân ống tế bào. Tiêu chuẩn: Số lượng tế bào sống giữa các ống tế bào đạt ≥ 9 % nồng độ 2x106 tb/ống/ml nằm trong khoảng ±2SD, và đặc tính phát triển và tính chất nuôi cấy là đặc trưng tế bào vero.
1.7.5. Thử nghiệm Mycoplasma
Phương pháp: Phát hiện mycoplasma bằng phương pháp trực tiếp PCR với cặp mồi chung phát hiện các loại mycoplasma [27;47];
Thử nghiệm có giá trị: Mẫu dương t nh phải xuất hiện, mẫu âm tính không xuất hiện băng tương ứng với k ch thước của mồi bp và băng marker DNA phải r nét khi điện di trên thạch agarose 3%.
Tiêu chuẩn: Thử nghiệm đạt yêu cầu khi không phát hiện mycoplasma trong mẫu.
1.7.6. Thử nghiệm kiểm tra các tác nhân ngoại lai
1.7.6.1. Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trưởng thành:
Mục đ ch: Phát hiện các vi rút gây độc ngoại lai nhiễm vào tế bào như vi rút viêm màng não mủ, coxsackieviruses, flaviviruses, và vi rút Dại.
Phương pháp: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên động vật thí nghiệm với tỷ lệ tế bào 1x107 tế bào/ ml/10ml trên số lượng chuột 10 con trọng lượng 15-20 gram/chuột.
Liều tiêm Đường tiêm/số lượng chuột: 0,5ml/ổ bụng/10 con và 10 con/nhóm chứng sau đó theo dõi 3 tuần (21 ngày).
Tiêu chuẩn: ≥ 8 % chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bện lý.
1.7.6.2. Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang:
Mục đích: Phát hiện các vi rút ngoại lai và vi khuẩn lao.
Phương pháp: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên động vật thí nghiệm với tỷ lệ tế bào 1 x 107 tế bào/ml/40ml với số lượng chuột 5 con với trọng lượng 350-450 gram/chuột sau đó theo d i 4 ngày.
Liều tiêm Đường tiêm/số lượng chuột: 5 ml/ổ bụng/con.
Tiêu chuẩn: ≥ 8 % chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.
1.7.6.3. Kiểm tra các tác nhân ngoại lai trên trứng gà có phôi:
Mục đ ch: Phát hiện các tác nhân gây nhiễm tế bào trong quá trình nuôi cấy và gặt là các loại vi rút cúm, sởi, quai bị…
Phương pháp: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên trứng gà có phôi với tỉ lệ tế bào 1 x 107 tế bào/ml/10ml với số lượng trứng gà có phôi là 10 quả 10-11 ngày tuổi.
Liều tiêm: 0,5 ml/quả.
Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy: Điều kiện 36±1oC/72h.
Tiêu chuẩn đánh giá: ≥ 8 % phôi gà sống sau 72h theo dõi và dịch niệu không có vi rút ngưng kết hồng cầu gà.
1.7.7. Kiểm tra phát hiện vi khuẩn lao
Phương pháp: Nuôi cấy 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trên môi trường Lowenstein Jenssen ở điều kiện 36±1oC trong thời gian 28 ngày. Nhuộm Zielh- Neelsen và quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu để phát hiện sự có mặt trực khuẩn Lao.
Tiêu chuẩn: Không phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu thử.
1.7.8. Kiểm tra tính ổn định của ngân hàng tế bào MCB và WCB theo thời gian khi bảo quản ở điều kiện tối ưu -700C khi bảo quản ở điều kiện tối ưu -700C
Phương pháp: Kiểm tra độ sống ngân hàng tế bào MCB và WCB khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C theo thời gian sau sản xuất 3 tháng; 6 tháng; 12 tháng. Tại mỗi thời điểm thử nghiệm được lặp lại 6 lần có so sánh kết quả với mẫu chuẩn quốc tế [9;10;14;16].
Tiêu chuẩn: Tại mỗi thời điểm số lượng tế bào sống trên mỗi ống tế bào ≥ 90% so với lúc sản xuất (2x106 tb/ống/1ml).
CHƢƠNG II
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng
Ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B do Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế sản xuất tháng 10/2017 với số lượng NICVB-MCB01-18A: 280 ống và NICVB-WCB01-18B: 1600 ống đưa vào nghiên cứu đánh giá chất lượng theo các tiêu chuẩn của WHO TRS 978, phần 3.
Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế và Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện 10/2017-12/2018
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đề ra, các nội dung nghiên cứu chính bao gồm:
- Xây dựng quy trình chuẩn Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế’’ đạt tiêu chuẩn theo quy định của WHO TRS No.978 phần 3
- Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B với các thử nghiệm sau:
+ Nhận dạng đặc hiệu tế bào vero (MCB và WCB) + Vô trùng (MCB và WCB)
+ Độ sống (MCB và WCB)
+ T nh đồng nhất giữa các ống tế bào (MCB và WCB) + Mycoplasma (MCB và WCB)
+ Tác nhân ngoại lai trên động vật thí nghiệm và trướng phôi gà (MCB) + Phát hiện vi khuẩn lao (MCB)
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Mẫu chuẩn và mẫu thử
- Ngân hàng tế bào vero 76 chuẩn gốc giống NICVB-MCB01-18A: 30 ống (2x106 tb/ống/ml).
- Ngân hàng tế bào vero 76 chuẩn làm việc NICVB-WCB01-18B: 100 ống (2x106 tb/ống/ml).
- Tế bào Vero chuẩn quốc tế ATCC 76 (ATCC CRL-1587): 5 ống.
- Trình tự Nucleotide tế bào vero chuẩn quốc tế NIBSC ATCC CRL-1587 trên ngân hàng Genbank (NCBI) mã số: L13119.
- Tế bào MDBK ATCC CCL-10 chủng làm việc: 5 ống (2x106 tb/ống/ml) - DNA của chủng Mycoplasma pneumoniae ATCC 29342: 01 ống (100ng/ml)
2.3.2. Các sinh phẩm, hóa chất:
- Truseq Strand mRNA LT set A hoặc B (RS-122-2101 hoặc RS-122-2102) - EpiScreipt Reverse Transcriptase (ERT12910K)
- RNA clean & Concentrator-5 (R1015) - Miseq Reagent Kit (MS-102-2002)
- Library Quantification Kit – Illumina (KK4824) - Các viên bi từ tính (Ampure Bead)
- Kit real-time RT-PCR Invitrogen
- Kit tách chiết DNA và ARN Qiagen, Đức) - Bộ sinh phẩm PCR Qiagen, Đức)
- Dung dịch AMPure XP bead ở 2-80C - Hóa chất điện di DNA
- Bộ thuốc nhuộm Zeihl Neelsen (Nam Khoa) - Tế bào Vero (ATCC, CRL-1587)
- L- Glutamin 200 mM (Sigma, M3641) - FBS (Sigma, F2442): 100 ml
- Kháng sinh: Peniciline và Streptomycine 10mg/ml (Gibco, 14200-075) - NaHCO37,5% (Gibco, 25080-094)
- Môi trường MEM 2%FBS - Neutral Red (mp- bio, 1023438) - Dung dịch phủ thạch MEM 2X - Agarose ME (Nisui-Nhật bản) - Eagle MEM (Wako –Nhật bản)
2.3.3. Các thiết bị chính
- Máy PCR (Applied Biosystem, Mỹ mã PC 04 VR)
- Máy PCR real-time 7500 FAST (Applied Biosystem, Mỹ) - Máy đo nồng độ DNA (Nanodrop- Thermo, Mỹ)
- Máy giải trình tự gen thế hệ mới (Illumina platform, Mỹ) - Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)
- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12-Sacase Biotechnology - Giá từ (Thermo, Mỹ)
- Pipetman đơn các loại 50 µl, 100-200µl, 1000 µl, 5000 µl (Gilson): mã GG29329, EJ87599, EG53274, 467106
- Máy lắc JK Mã : VT 03 VR/ Thermo VT 04 VR. - Pipet aid Model 4-000-220, USA
- ơm chân không Gallekamp mã VP 1 VR - Bể ổn nhiệt (Shel - Lab) mã WB 03 VR - Máy đo pH Themor) mã pH-14 VR - Tủ cấy vô trùng (Nuaire) mã LH 06 VR
- Cân phân t ch độ nhạy . 1g Sartorius, Đức) - Kính hiển vi quang học (Olympus SZ61, Nhật Bản) - Bộ lọc 1lít có đường kính màng lọc , μm
- Tủ ấm CO2 Astec SCA-165DS - Tủ lạnh SANYO 2-80C
2.3.4. Các dụng cụ và nguyên vật liệu khác
- Phiến nhựa 96 giếng (Nunc) - Phiến nhựa 6 giếng (Nunc) - Phiến pha loãng (Nunc)
- Tube vô trùng 15ml; 25ml và 50ml - Lá kính cho thử nghiệm PCR
- Tube Eppendorf 1,8ml vô trùng và không có RNAse
- Một số vật liệu tiêu hao cơ bản khác dùng trong sinh học phân tử
- Bình lọc môi trường vô trùng loại 1000ml, 500ml (Corning): 1 bộ/ loại - Đầu côn 200µl, 1000µl, 5000µl (Eppendorf)
- Phiến 06 giếng đáy bằng (Corstar/ Nunc ) - Ống đong thuỷ tinh 500 ml (Schott Duran) - Cốc thuỷ tinh có mỏ 1000 ml (Schott Duran) - Chai thuỷ tinh 1000 ml (Schott Duran) - Pipet nhựa vô trùng 5ml, 10ml, 25ml
- Một số dụng cụ khác dùng trong nuôi cấy tế bào
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B sau khi sản xuất tại NICVB sẽ được bảo quản tại điều kiện tối ưu -700C và tiến hành nghiên cứu đánh giá chất lượng theo phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phòng thí nghiệm (in vitro và in vivo).
2.4.1. Thiết kế mô hình nghiên cứu
Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero được thực hiện theo hướng dẫn của WHO TRS No.978, Annex 3, 2013 và WHO TRS No.993, 2006 như bảng hình 2.1.
Phương pháp chọn mẫu: Ngân hàng tế bào vero 76 chuẩn (NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B được sản xuất lại NICVB từ 3/2017, bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C, số lượng tương ứng là (MCB: 280 ống; WCB: 1600 ống ước t nh đủ dùng cho công tác kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế tại NICVB và các Labo kiểm định trên toàn quốc trong thời gian trên 1 năm.
* Nghiên cứu, tham khảo tài liệu hướng dẫn của WHO xây dựng quy trình chuẩn (SOP) Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn của WHO TRS No 978, phần 3, 2013.
* Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 (NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B) theo quy trình chuẩn đã xây dựng bao gồm:
- Kiểm tra nhận dạng đặc hiệu tế bào vero bằng phương pháp PCR và Sequencing.
- Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường tăng sinh phát hiện vi khuẩn và nấm.
- Kiểm tra độ sống tế bào vero bằng phương pháp nuôi cấy, mô tả hình thái tế bào đặc hiệu, đếm độ sống tế bào trên kính hiển vi quang học.
- Kiểm tra t nh đồng nhất giữa các ống bằng phương pháp nuôi cấy xác định độ sống các ổng tế bào vero tại các thời điểm đầu-giũa và cuối của quy trình phân ống tế bào, phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excell.
- Kiểm tra Mycoplasma bằng phương pháp PCR mồi tổng hợp cho các loài mycoplasma với gene 16S rRNA k ch thước 1500bp.
- Kiểm tra các tác nhân ngoại lai bao gồm:
+ Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trưởng thành bằng phương pháp tiêm ổ bụng dung dịch tế bào 107/ml cho chuột trọng lượng 15-20g/chuột và theo dõi trong 21 ngày.
+ Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang bằng phương pháp tiêm ổ bụng dung dịch tế bào 107/ml cho chuột trọng lượng 350-450g/chuột và theo dõi trong 42 ngày.
+ Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên trứng gà phôi bằng phương pháp tiêm .5ml dung dịch tế bào 107/ml /trứng 10-11 ngày tuổi và nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 350C trong 72h.
- Đánh giá tính ổn định của ngân hàng tế bào vero 76 MCB và WCB trong điều kiện bảo quản tối ưu -700C trong điều kiện Ni tơ lỏng theo thời gian 3 tháng, 6 tháng, 12 tháng sau sản xuất.
Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu 2.4.2. Kỹ thuật nghiên cứu
2.4.2.1. Xây dựng qui trình chuẩn (SOP) “ uy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế”.
Phương pháp: Tham khảo các tài liệu hướng dẫn của WHO và CDC về thiết lập chuẩn quốc tế và chuẩn quốc gia, đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero MCB và WCB chuẩn quốc gia dùng cho sản xuất và kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế.
Tiêu chuẩn: Các tiêu chuẩn chất lượng của MC và WC đạt yêu cầu của WHO trong tài liệu hướng dẫn WHO TRS No.978, phần 3, 2013 và WHO TRS No. 993, 2006.
2.4.2.2. Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 (NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B) bao gồm:
Kiểm tra nhận dạng tế bào vero
Phương pháp: Sử dụng phương pháp nhận dạng trực tiếp PCR với cặp mồi đặc hiệu trên trình tự DNA người cho tế bào vero 76 CRL1587 trên Genbank-NCBI mã số L13119.
Tiến hành:
+ Tách chiết DNA: Mẫu thử là tế bào vero 76 (MCB và WCB) và mẫu âm tính là tế bào MDBK ATCC-CCL-10 sau khi nuôi cấy trên môi trường MEM10%FBS có nồng độ 2x106 tế bào/typ/ml được tách chiết bằng Kit DNA extract Qiagen. Sau đó xác định nồng độ DNA trên máy Nanodrop ở bước sóng 260nm. Sử dụng mẫu dương t nh là WHO vero 76 ATCC-CRL 1587 do NIBSC cung cấp.
+ Primer: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi phần mềm (Primer3
software http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input. htm) trên trình tự DNA người tế
bào vero tại vị trí (loci) D19525 trên Genbank-NCBI mã số L13119 k ch thước 245bp có trình tự (F-GACCTGCAATCAGCCATTTT và R- GTTCTTGCAGTCTGTGGCTTG) tham khảo từ bài báo khoa học (Almeida et al.
BMC Biotechnology 2011, 11:102)
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhận dạng tế bào vero
+ Điều kiện phản ứng PCR trên máy Applied Biosystem, Mỹ
Bảng 2.2 Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR nhận dạng tế bào vero
Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
95oC 11 phút 45 94 oC 1 phút 59oC 2 phút 72oC 1 phút 60oC 15 phút 4oC ∞
Tiêu chuẩn đánh giá: 1 % trình tự nucleic DNA của tế bào vero giống mẫu chuẩn quốc tế và so sánh trên Genbank code đối với 8 locut đã công bố trên NCBI quốc tế.
+ Điện di sản phẩm PCR trên thạch Agarose 3% ở điều kiện 100v thời gian 35 phút, và kiểm tra kết quả PCR trên máy SONY-UV soi gel có chụp ảnh.
Đọc kết quả: Thử nghiệm có giá trị khi xuất hiện băng điện di mẫu âm tương ứng với k ch thước mồi 245bp, mẫu âm không xuất hiện băng điện di, băng DNA
Hóa chất Thể tích/ống phản ứng (µl)
F:Mồi xuôi 0.20mg/ml (µl) 4 µl
R: Mồi ngược 0.20mg/ml (µl) 4 µl
dNTPs 5 μM 4 µl
μM MgCl 4 µl
1 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase 4 µl
1× GeneAmp PCR Gold buffer 8 µl
0.16 mg/mL BSA 8 µl
DNA mẫu 10ng/µl 5µl
Tiêu chuẩn chấp thuận: Xuất hiện băng điện di tương ứng với mồi k ch thước 45bp đối với mẫu thử nghiệm tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB- WCB01-18B.
Kiểm tra vô trùng
- Phương pháp: Nuôi cây trực tiếp trên môi trường tăng sinh thích hợp. - Môi trường và nhiệt độ nuôi cấy: Thioglycolate/30-35oC và Soybean/20-25oC. - Số lượng ống tế bào kiểm tra: 10 ống.