1. Môi trường nuôi cấy
2.4.1. Thiết kế mô hình nghiên cứu
Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero được thực hiện theo hướng dẫn của WHO TRS No.978, Annex 3, 2013 và WHO TRS No.993, 2006 như bảng hình 2.1.
Phương pháp chọn mẫu: Ngân hàng tế bào vero 76 chuẩn (NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B được sản xuất lại NICVB từ 3/2017, bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C, số lượng tương ứng là (MCB: 280 ống; WCB: 1600 ống ước t nh đủ dùng cho công tác kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế tại NICVB và các Labo kiểm định trên toàn quốc trong thời gian trên 1 năm.
* Nghiên cứu, tham khảo tài liệu hướng dẫn của WHO xây dựng quy trình chuẩn (SOP) Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn của WHO TRS No 978, phần 3, 2013.
* Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 (NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B) theo quy trình chuẩn đã xây dựng bao gồm:
- Kiểm tra nhận dạng đặc hiệu tế bào vero bằng phương pháp PCR và Sequencing.
- Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường tăng sinh phát hiện vi khuẩn và nấm.
- Kiểm tra độ sống tế bào vero bằng phương pháp nuôi cấy, mô tả hình thái tế bào đặc hiệu, đếm độ sống tế bào trên kính hiển vi quang học.
- Kiểm tra t nh đồng nhất giữa các ống bằng phương pháp nuôi cấy xác định độ sống các ổng tế bào vero tại các thời điểm đầu-giũa và cuối của quy trình phân ống tế bào, phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excell.
- Kiểm tra Mycoplasma bằng phương pháp PCR mồi tổng hợp cho các loài mycoplasma với gene 16S rRNA k ch thước 1500bp.
- Kiểm tra các tác nhân ngoại lai bao gồm:
+ Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trưởng thành bằng phương pháp tiêm ổ bụng dung dịch tế bào 107/ml cho chuột trọng lượng 15-20g/chuột và theo dõi trong 21 ngày.
+ Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang bằng phương pháp tiêm ổ bụng dung dịch tế bào 107/ml cho chuột trọng lượng 350-450g/chuột và theo dõi trong 42 ngày.
+ Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên trứng gà phôi bằng phương pháp tiêm .5ml dung dịch tế bào 107/ml /trứng 10-11 ngày tuổi và nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 350C trong 72h.
- Đánh giá tính ổn định của ngân hàng tế bào vero 76 MCB và WCB trong điều kiện bảo quản tối ưu -700C trong điều kiện Ni tơ lỏng theo thời gian 3 tháng, 6 tháng, 12 tháng sau sản xuất.
Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu 2.4.2. Kỹ thuật nghiên cứu
2.4.2.1. Xây dựng qui trình chuẩn (SOP) “ uy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế”.
Phương pháp: Tham khảo các tài liệu hướng dẫn của WHO và CDC về thiết lập chuẩn quốc tế và chuẩn quốc gia, đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero MCB và WCB chuẩn quốc gia dùng cho sản xuất và kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế.
Tiêu chuẩn: Các tiêu chuẩn chất lượng của MC và WC đạt yêu cầu của WHO trong tài liệu hướng dẫn WHO TRS No.978, phần 3, 2013 và WHO TRS No. 993, 2006.
2.4.2.2. Đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 (NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B) bao gồm:
Kiểm tra nhận dạng tế bào vero
Phương pháp: Sử dụng phương pháp nhận dạng trực tiếp PCR với cặp mồi đặc hiệu trên trình tự DNA người cho tế bào vero 76 CRL1587 trên Genbank-NCBI mã số L13119.
Tiến hành:
+ Tách chiết DNA: Mẫu thử là tế bào vero 76 (MCB và WCB) và mẫu âm tính là tế bào MDBK ATCC-CCL-10 sau khi nuôi cấy trên môi trường MEM10%FBS có nồng độ 2x106 tế bào/typ/ml được tách chiết bằng Kit DNA extract Qiagen. Sau đó xác định nồng độ DNA trên máy Nanodrop ở bước sóng 260nm. Sử dụng mẫu dương t nh là WHO vero 76 ATCC-CRL 1587 do NIBSC cung cấp.
+ Primer: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi phần mềm (Primer3
software http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input. htm) trên trình tự DNA người tế
bào vero tại vị trí (loci) D19525 trên Genbank-NCBI mã số L13119 k ch thước 245bp có trình tự (F-GACCTGCAATCAGCCATTTT và R- GTTCTTGCAGTCTGTGGCTTG) tham khảo từ bài báo khoa học (Almeida et al.
BMC Biotechnology 2011, 11:102)
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhận dạng tế bào vero
+ Điều kiện phản ứng PCR trên máy Applied Biosystem, Mỹ
Bảng 2.2 Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR nhận dạng tế bào vero
Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
95oC 11 phút 45 94 oC 1 phút 59oC 2 phút 72oC 1 phút 60oC 15 phút 4oC ∞
Tiêu chuẩn đánh giá: 1 % trình tự nucleic DNA của tế bào vero giống mẫu chuẩn quốc tế và so sánh trên Genbank code đối với 8 locut đã công bố trên NCBI quốc tế.
+ Điện di sản phẩm PCR trên thạch Agarose 3% ở điều kiện 100v thời gian 35 phút, và kiểm tra kết quả PCR trên máy SONY-UV soi gel có chụp ảnh.
Đọc kết quả: Thử nghiệm có giá trị khi xuất hiện băng điện di mẫu âm tương ứng với k ch thước mồi 245bp, mẫu âm không xuất hiện băng điện di, băng DNA
Hóa chất Thể tích/ống phản ứng (µl)
F:Mồi xuôi 0.20mg/ml (µl) 4 µl
R: Mồi ngược 0.20mg/ml (µl) 4 µl
dNTPs 5 μM 4 µl
μM MgCl 4 µl
1 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase 4 µl
1× GeneAmp PCR Gold buffer 8 µl
0.16 mg/mL BSA 8 µl
DNA mẫu 10ng/µl 5µl
Tiêu chuẩn chấp thuận: Xuất hiện băng điện di tương ứng với mồi k ch thước 45bp đối với mẫu thử nghiệm tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB- WCB01-18B.
Kiểm tra vô trùng
- Phương pháp: Nuôi cây trực tiếp trên môi trường tăng sinh thích hợp. - Môi trường và nhiệt độ nuôi cấy: Thioglycolate/30-35oC và Soybean/20-25oC. - Số lượng ống tế bào kiểm tra: 10 ống.
- Số lượng ống môi trường: 5 ống Thioglycolate và 5 ống Soybean. - Thể tích cấy: 1ml dung dịch tế bào 106 tế bào/ống môi trường.
- Tiêu chuẩn chấp thuận: Không phát hiện thấy nấm và tạp khuẩn sau 14 ngày nuôi cây theo dõi.
Kiểm tra độ sống các typ (ống) tế bào vero 76 NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B
Phương pháp: Kiểm tra độ sống bằng phương pháp nuôi cấy tế bào trên môi trường MEM10%FBS nhằm xác định nồng độ tế bào sống trên mỗi đơn vị ống sau khi cất giữ tế bào và hoàn thành ngân hàng MCB và WCB.
Đọc kết quả: Sau khi nuôi cấy tế bào trên môi trường MEM10%FBS với tủ ấm 37o
C, 5% CO2, quan sát hình thái và đếm độ sống tế bào trên kính hiển vi quang học.
Tiêu chuẩn đánh giá: Số lượng tế bào sống mỗi ống tế bào (MCB và WCB) ≥ 8 % so với khi cất tế bào 2x106
tế bào/typ/ml.
Kiểm tra tính đồng nhất giữa các ống tế bào vero 76 NICVB- MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B.
Phương pháp: Xác định độ sống các ống tế bào vero 76 MCB01-18A và WCB01-18B ở các giai đoạn đầu, giữa và cuối của quy trình phân ống (typ) tế bào nhằm xác định t nh đồng nhất giữa các ống tế bào vero trong MCB và WCB.
Tiến hành: Xác định số độ sống và đặc tính phát triển hình thái, độ sống, thời gian nhân đôi tế bào) với số lượng 9 ống tế bào lấy ngẫu nhiên ở các giai đoạn đầu- giữa-cuối trong quá trình chia týp tế bào).
Tiêu chuẩn đánh giá: Độ sống các ống tế bào ≥ 90% so với khi cất giữ (nồng độ 2x106
tế bào/typ/ml). Số lượng tế bào sống giữa các ống tế bào nằm trong khoảng ± SD và đặc tính phát triển ống tế bào là như nhau.
Kiểm tra phát hiện Mycoplasma
Phương pháp: Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi tổng hợp gene 16S rRNA k ch thước 1500bp sử dụng trình tự gene 16S rRNA của M.capricolumsubsp.
capricolumstrain California Kid (Genbank-NCBI: 83283139) tham khảo từ tạp chí
khoa học (Audrey Jean et al. pone.0172358 February 22, 2017). Tiến hành:
+ Tách chiết DNA: Mẫu thử là tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B được tách chiết trên máy tách chiết tự RNA DNA động SaMag 12-Sacase Biotechnology (Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn, đánh số thứ tự mẫu, chứng dương là Mycoplasma pneumoniae ATCC29342,chứng âm là DNA vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus ATCC VR3232SD) vào ống đựng mẫu và ống đựng DNA trên khay mẫu của máy tách chiết DNA/RNA tự động, dùng micropipette hút 10µl RNA carier và 10µl chứng dương vào ống đựng mẫu, hút 200 µl dung dịch tế bào MCB và WCB, chứng dương, vào các ống đựng mẫu theo số thứ tự, đặt khay đựng mẫu vào máy tách chiết DNA-RNA tự động, dùng đầu đọc mã code FCO AS – 81 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy, ấn Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA. DNA sau khi được tách chiết xác định nồng độ DNA trên máy Nanodrop ở bước sóng 260nm bảo quản ở tủ -20°C. Sau đó xác định nồng độ DNA trên máy Nanodrop ở bước sóng 260nm. Sử dụng mẫu dương t nh là DNA WHO vero 76 ATCC-CRL 1587 do NIBSC cung cấp.
+ Primer: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi phần mềm (Primer3
software http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input. htm như sau:
16S U1 F- GTTTGATCCTGGCTCAGGAYDAAC 16S U8 R- GAAAGGAGGTRWTCCAYCCSCAC
Tham khảo (Audrey Jean et al. pone.0172358 February 22, 2017) + Thành phần phản ứng PCR tổng thể tich 40µl
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR phát hiện Mycoplasma
+ Điều kiện phản ứng PCR trên máy Applied Biosystem, Mỹ
Bảng 2.4 Điều kiện phản ứng chu kỳ nhiệt PCR phát hiện Mycoplasma
Nhiệt độ Thời gian Số chu kì
95oC 10 phút 40 95 oC 1 phút 65oC 2 phút 72oC 1 phút 72oC 10 phút 4oC ∞
Tiêu chuẩn đánh giá:
Đọc kết quả: Thử nghiệm có giá trị khi xuất hiện băng điện di mẫu dương tương ứng với k ch thước mồi 1500bp, mẫu âm không xuất hiện băng điện di, băng DNA marker 1500bp khi điện di sản phẩm PCR trên thạch Agarose 3% ở điều kiện 100v thời gian 35 phút, và kiểm tra kết quả PCR trên máy SONY-UV soi gel có chụp ảnh. Hóa chất Thể tích/ống phản ứng (µl) F: Mồi xuôi 20µM 5 µl R: Mồi ngược 20µM 5 µl dNTPs 5 μM 4 µl μM MgCl 4 µl Enzym 4 µl Buffe 8 µl H2O 5 µl DNA mẫu 10ng/µl 5µl Tổng thể tích 40 µl
Tiêu chuẩn chấp thuận: Không phát hiện Mycoplasma trong mẫu tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B .
Kiểm tra các tác nhân ngoại lai ngân hàng vero 76 NICVB- MCB01-18A
Kiểm tra các tác nhân ngoại lai trên chuột nhắt trưởng thành.
Phương pháp: Phát hiện các vi rút gây độc ngoại lai nhiễm vào tế bào như vi rút viêm màng não mủ, coxsackieviruses, flavivirus, và vi rút Dại nhiễm vào tế bào trong quá trình nuôi cấy và đóng ống trên động vật chuột nhắt trưởng thành.
Tiến hành: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên động vật thí nghiệm với tỷ lệ tế bào 1 x 106 tế bào/ml/10ml trên số lượng chuột 10 con trọng lượng 15-20 gram/chuột. Và 10 chuột nhóm chứng.
Liều tiêm Đường tiêm/số lượng chuột: 0,5ml/ổ bụng/10 con và 10 con/nhóm chứng sau đó theo d i 3 tuần (21 ngày).
Tiêu chuẩn: ≥ 8 % chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bện lý.
Kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chuột lang:
Phương pháp: Phát hiện các vi rút ngoại lai và vi khuẩn lao có thể gây nhiễm vào tế bào trong quá trình nuôi cấy và đóng ống trên chuột lang. Tiến hành: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên động vật thí nghiệm với tỷ lệ tế bào 1 x 106 tế bào/ml/40ml với số lượng chuột 5 con với trọng lượng 350-450 gram/chuột sau đó theo d i 4 ngày.
Liều tiêm Đường tiêm/số lượng chuột: 5 ml/ổ bụng/con.
Tiêu chuẩn: ≥ 8 % chuột sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.
Kiểm tra các tác nhân ngoại lai trên trứng gà có phôi:
Phương pháp: Phát hiện các tác nhân gây nhiễm tế bào trong quá trình nuôi cấy và gặt là các loại vi rút cúm, sởi, quai bị có thể lây nhiễm trong quá trình nuôi cấy và đóng ống.
Tiến hành: Gây nhiễm hỗn dịch tế bào trên trứng gà có phôi với tỷ lệ tế bào 1 x 107 tế bào/ml/10ml với số lượng trứng gà có phôi là 10 quả (10 đến 11 ngày tuổi).
Liều tiêm: 0,5 ml/quả.
Tiêu chuẩn đánh giá: ≥ 8 % phôi gà sống sau 72h theo dõi và dịch niệu không có vi rút ngưng kết hồng cầu gà.
Kiểm tra phát hiện vi khuẩn lao
Phương pháp: Phát hiện vi khuẩn lao trong tế bào vero 76 MCB01-18A và WCB01-18B bằng phương pháp nhuộm Zielh-Neelsen phát hiện trực khuẩn lao đặc hiệu khi quan sát trên kính hiển vi.
Tiến hành: Nuôi cấy 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trên môi trường Lowenstein Jenssen ở điều kiện 36±1oC trong thời gian 28 ngày. Nhuộm Zielh- Neelsen và quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu để phát hiện sự có mặt trực khuẩn Lao.
Tiêu chuẩn: Không phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu thử.
Kiểm tra tính ổn định của ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-
MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B khi bảo quản ở điều kiện tối ưu -700C.
Phương pháp: Xác định độ sống của các ống tế bào vero 76 NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường MEM10%FBS tại các thời điểm khác nhau trong điều kiện bảo quản tối ưu.
Tiến hành: Kiểm tra độ sống ngân hàng tế bào vero 76 MCB01-18A và WCB 01-18B khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C trong Nitơ lỏng theo thời gian sau sản xuất 3 tháng; 6 tháng; 12 tháng. Tại mỗi thời điểm thử nghiệm được lặp lại 6 lần.
Tiêu chuẩn: Tại mỗi thời điểm số lượng tế bào sống trên mỗi ống tế bào ≥ 90% so với lúc sản xuất (2 x 106 tế bào/typ/ml).
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Qui trình sản xuất ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và vero 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia 76 NICVB-WCB01-18B chuẩn quốc gia
Ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và vero 76 NICVB- WCB01-18B chuẩn quốc gia được sản xuất theo qui trình hướng dẫn theo WHO TRS No. 932,2006 như hình 3.1 . Sử dụng chủng tế bào gốc chuẩn quốc tế do NIBSC cung cấp là chủng vero 76 ATCC CRL 1587 đời cấy chuyển 131, được nuôi cấy và sản xuất ngân hàng tế bào vero vero chủng làm việc là vero 76 NICVB- WCB01-18B ở đời cấy chuyển 140 sử dụng để đánh giá chất lượng với các tiêu chí chất lượng theo tiêu chuẩn WHO TRS No 978,2013.
Sau khi ngân hàng vế bào vero 76 chuẩn đạt các tiêu chí chất lượng sẽ được sử dụng từ đời cấy chuyển lần thứ 140-156 dùng cho kiểm định chất lượng vắc xin và sinh phẩm y tế tại NICVB và các phòng kiểm định trên toàn quốc.
3.2. Quy trình chuẩn “ uy tr nh chuẩn đánh giá chất lƣợng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” theo tiêu chuẩn WHO TRS No. 978, phần 3, 2013.
Ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B sau khi sản xuất và dán nhãn tại NICV như (hình 3.2) và được tiến hành đánh giá chất lượng theo tiêu chuẩn hướng dẫn của WHO TRS No. 978, phần 3, 2013.
Hình 3.2 Tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B
(Xem phần phụ lục 1: Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế).
3.2. Kết quả kiểm tra chất lƣợng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01- 18A và NICVB-MCB01-18B
3.2.1. Kết quả kiểm tra nhận dạng tế bào vero 76 MCB01-18A và WCB01-18B
Ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B