1. Môi trường nuôi cấy
3.2.7. Kết quả kiểm tra vi khuẩn lao trong tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và
NICVB-WCB01-18B
Thử nghiệm kiểm tra vi khuẩn lao trong ngân hàng tế bào vero 76 NICVB- MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B bằng phương pháp nuôi cấy và nhuộm hỗn
dịch tế bào nồng độ 106 tế bào/ml Zielh-Neelsen phát hiện trực khuẩn lao đặc hiệu khi quan sát trên kính hiển vi quang học cho kết quả như bảng 3.6).
Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra phát hiện trực khuẩn lao trong tế bào vero 76 NICVB- MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B
STT Mẫu thử Phƣơng pháp Tiêu chuẩn Kết quả
1 NICVB-MCB01-18A Nhuộm Zielh- Neelsen
Không phát hiện trực khuẩn lao khi quan sát trên kính
hiển vi
Không có
2 NICVB-WCB01-18B Nhuộm Zielh- Neelsen
Không phát hiện trực khuẩn lao khi quan sát trên kính
hiển vi
Không có
Kết quả bảng 3.6 cho thấy không phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn lao trong ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18 . Đạt tiêu chuẩn của WHO TRS No. 978, phần 3, 2013.
3.2.8. Kết quả kiểm tra tính ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B khi bảo quản điều kiện -700C theo thời gian
Tiến hành đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01- 18A và NICVB-WCB01-18B khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C trong Nitơ lỏng tại các thời điểm 3 tháng; 6 tháng và 1 tháng sau đóng ống (sản xuất). Tại mỗi thời điểm kiểm tra độ sống tế bào được lặp lại 6 lần cho kết quả tính ổn định độ sống theo thời gian ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A như bảng 3.7 và hình 3.5) và kết quả tính ổn định độ sống theo thời gian của tế bào vero 76 NICVB- WCB01-18 như bảng 3.8 và hình 3.6)
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB- MCB01-18A khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu the thời gian
Mẫu Thời gian Tiêu chuẩn Kết quả
(106/ml) Xtb (106/ml) Vero 76 N ICVB -MC B01 -18A 3 tháng 1 ≥ 1,8 x106/ml 2,04 2,05 2 2,0 3 1,86 4 2,14 5 2,35 6 1,96 6 tháng 1 2,08 2,15 2 1,98 3 2,08 4 2,24 5 2,38 6 2,16 12 tháng 1 2,08 2,09 2 2,04 3 2,34 4 1,98 5 1,88 6 2,02 P (Anova) 0,32 (P>0.05) GM 2,086 SD 0,035
Hình 3.6 Kết quả tính ổn định độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy độ sống tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A đạt yêu cầu khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C trong điều kiện Ni tơ lỏng tại các thời điểm sau đóng ống 3 tháng; 6 tháng và 12 tháng cho kết quả độ sống trung bình là 2,05; 2,15; 2,09 x106 tế bào/ống ml đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ≥ 1,8 x 1 6 tế bào/ống/ml ≥9 % độ sống tế bào sau khi sản xuất) với P= .3 ˃ . 5 không có sự khác biệt có nghĩa thống kê. Hình 3.6 cho thấy các kết quả độ sống ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A đều nằm trong giới hạn GM±2SD.
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB- WCB01-18B khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu the thời gian
Mẫu Thời gian Tiêu chuẩn Kết quả
(106/ml) Xtb (106/ml) Vero 76 N ICVB -WC B01 -18B 3 tháng 1 ≥ 1,8 x106/ml 1,98 2,11 2 2,06 3 1,95 4 2,36 5 2,24 6 2,08 6 tháng 1 2,02 2,06 2 1,95 3 2,06 4 2,14
5 2,28 6 1.94 12 tháng 1 2,06 1,98 2 1,89 3 2,02 4 1,95 5 1,85 6 2,12 P (Anova) 0,24 (P>0.05) GM 2,05 SD 0,065
Hình 3.7 Kết quả tính ổn định độ sống tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy độ sống tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B đạt yêu cầu khi bảo quản ở nhiệt độ tối ưu -700C trong điều kiện Nitơ lỏng tại các thời điểm sau đóng ống 3 tháng; 6 tháng và 12 tháng cho kết quả độ sống trung bình là 2,11; 2,06; 1,98 x106 tế bào/ống ml đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ≥ 1,8 x 1 6 tế bào/ống/ml ≥9 % độ sống tế bào sau khi sản xuất) với P= . 4 ˃ . 5 không có sự khác biệt có nghĩa thống kê. Hình 3.7 cho thấy các kết quả độ sống ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B đều nằm trong giới hạn GM±2SD.
CHƢƠNG IV BÀN LUẬN
4.1. Tính cấp thiết của việc thiết lập và đánh giá chất lƣợng ngân hàng tế bào vero đạt tiêu chuẩn WHO TRS No. 978, 2013.
Thực tế cho thấy trong nhiều thập niên gần đây, việc đưa sử dụng vắc xin trong Chương trình TCMR Quốc gia phòng bệnh chủ động các bệnh truyền nhiễm cho trẻ em và cộng đồng đã thu được thành quả to lớn làm giảm tỷ lệ mắc và tử vong cũng như thanh toán được nhiều bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như bại liệt, uốn ván sơ sinh, sởi, viêm gan sơ sinh, bạch hầu, tả...). Việc tiếp tục nghiên cứu và đưa thêm nhiều loại vắc xin vào Chương trình TCMR và tiêm phòng dịch vụ tại các cơ sở y tế là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Do vậy công tác kiểm định chất lượng vắc xin, lựa chọn ra các loại vắc xin đảm bảo chất lượng, an toàn trước khi sử dụng cho cộng đồng là cần thiết và quan trọng.
Đặc thù cho thấy các vắc xin và sinh phẩm y học là các chế phẩm đặc thù (với bản chất là kháng nguyên), do vậy các quy trình và kỹ thuật kiểm tra chất lượng rất nghiêm ngặt bảo đảm từ nguyên liệu đầu cho tới khi xuất xưởng và được cơ quan kiểm định quốc gia NICV đánh giá chất lượng ở khâu cuối cùng trước khi cấp phép lưu hành sử dụng cho cộng đồng. Việc đánh giá chất lượng trong phòng thí nghiệm bắt buộc phải sử dụng các mẫu chuẩn là (vắc xin mẫu chuẩn, vật liệu chuẩn...) có thể là chuẩn quốc tế (MCQT) do WHO cung cấp hoặc chuẩn quốc gia MCQG do cơ quan kiểm định quốc gia mỗi nước nghiên cứu thiết lập và quản lý sử dụng trên toàn quốc [43;44].
Để chủ động trong công tác chuyên môn và nhằm nâng cao năng lực của cơ quan quản lý quốc gia vắc xin (NRA), WHO khuyến cáo các cơ quan kiểm định quốc gia (NCL) nên chủ động nghiên cứu thiết lập các MCQG cho riêng mình để phục vụ kiểm định chất lượng tại kiểm định quốc gia và các phòng kiểm định tại nhà sản xuất.
Mặt khác, thực tế hiện nay tại NICVB tiến hành kiểm định chất lượng nhiều loại vắc xin vi rút và sinh phẩm y tế như vắc xin sởi, quai bị, rubellar, viêm não
nhật bản B, cúm mùa...) sử dụng dòng tế bào vero do WHO cung cấp qua cơ quan kiểm định quốc gia Anh (NIBSC) số lượng không nhiều 1-2 ống năm và công tác vận chuyển, bảo quản và kiểm soát chất lượng trong quá trình vận chuyển khó khăn hoặc do nhà sản xuất cung cấp cũng không thường xuyên. Do vậy không chủ động và sau khi xuất xưởng các sản phẩm vắc xin và sinh phẩm sử dụng trên thị trường khi có sự cố hoặc khi giám sát và lấy mẫu về làm kiểm định lại tại NICV cũng khó khăn trong việc cung cấp tế bào vero phục vụ kiểm định.
Do vậy, nhu cầu cấp thiết là phải xây dựng một ngân hàng chuẩn tế bào vero đạt yêu cầu về chất lượng theo tiêu chuẩn của WHO TRS No. 978, phần 3, 2013 để chủ động quản lý và cung cấp cho các phòng kiểm định trên cả nước và tại NICV để chủ động trong công tác kiểm định, nâng cao năng lực của cơ quan kiểm định quốc gia (NICVB) là cấp thiết cần được thực hiện. Qua nghiên cứu đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B được nghiên cứu và sản xuất tại NICVB sử dụng tế bào nguồn từ chủng quốc tế do WHO cung cấp là vero 76 ATCC- CRL-1587 [40;41;42].
4.2. Xây dựng qui trình chuẩn “ uy tr nh chuẩn đánh giá chất lƣợng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” đạt tiêu chuẩn WHO
Do nhu cầu cấp thiết và khuyến cáo của WHO cho NCL của mỗi quốc gia nên chủ động thiết lập hệ thống thiết lập, quản lý, bảo quản và cung cấp cho hệ thống các labo kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế trên toàn quốc. Ngân hàng tế bào gốc giống và tế bào làm việc vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB- WCB01-18 được sản xuất tại NICVB theo tiêu chuẩn của WHO TRS No. 978, 2013 cần phải nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero 76 [35;42].
Sau khi tham khảo các tài liệu hướng dẫn của WHO và các đơn vị liên quan khác nhóm thực hiện đề tài đã xây dựng quy trình chuẩn (SOP) Quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” Số: MT06-16 sau khi được phê duyệt là tài liệu chính thống được áp dụng cho đánh giá chất lượng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B.
4.3. Đánh giá chất lƣợng ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B
Ngân hàng mẫu chuẩn tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB- WCB01-18 được nghiên cứu và sản xuất tại NICVB theo tiêu chuẩn WHO TRS No.978, Annex 3, 13 và WHO TRS No. 993, 6 được đánh giá chất lượng theo quy trình chuẩn đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế” Số: MT06-16 được NICVB phê duyệt và áp dụng tại NICVB và các labo kiểm định vắc xin và sinh phẩm trên toàn quốc với các tiêu chí sau:
- Đạt yêu cầu nhận dạng đặc hiệu bằng phương pháp PCR cho cả ngân hàng tế vào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B với kết quả tại bảng 3.2 cho thấy sản phẩm khuyết đại PCR của mẫu thử và mẫu chứng dương đều xuất hiện sau khi điện di trên gel agarose 3% tương đương với kích thước độ dài DNA là 245 bp, chứng âm không xuất hiện băng điện di. Kết quả nghiên cứu đề tài tương đồng với phương pháp của tác giả (Almeida et al. BMC Biotechnology 2011,
11:102) và (Vincent-Falquet J et al. Developments in Biological Standardization 1989, 70(1):53-56.) [48].
- Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường tăng sinh trong điều kiện thích hợp cho kết quả như bảng 3.1 là ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18 đạt yêu cầu về vô trùng theo tiêu chuẩn của WHO và Dược điển Việt Nam V.
- Độ sống sau khi sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường MEN10%FBS cho kết quả hình thái tế bào vero đặc trưng khi quan sát trên kính hiển vi sau 7 ngày nuôi cấy (hình 3.3). Như vậy, độ sống ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A là 2,02 x 106 tế bào/ống/ml và ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-WCB01-18B là 2,1 x 106 tế bào/ống/ml. Kết quả trên đáp ứng tiêu chuẩn ≥ 90% so với nồng độ tế bào sống sau khi đóng ống là 2 x106 tế bào/ống/ml [42].
- T nh đồng nhất giữa các ống tế bào trong ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B khi tiến hành kiểm tra độ sống tại các thời điểm đầu - giữa - cuối quy trình đóng ống đều cho kết quả đạt yêu cầu đối với NICVB-MCB01-18A độ sống trung bình là 1,95 x 106 tế bào/ống/ml và từng
kết quả các lần thử nghiệm kiểm tra tại các thời điểm đều ≥ 9 % so với sau khi phân ống là ≥ 1,8 x1 6 tế bào/ống ml. Đối với ngân hàng tế bào vero 76 NICVB- WCB01-18 độ sống trung bình 2,05 x 106 tế bào/ống/ml và từng kết quả các lần thử nghiệm kiểm tra tại các thời điểm đều ≥ 9 % so với sau khi phân ống là ≥ 1,8 x106 tế bào/ống/ml. Từ kết quả trên cho thấy ngân hàng tế bào vero 76 NICVB- MCB01-18A và NICVB-WCB01-18 đạt yêu cầu về t nh đồng nhất giữa các ống theo tiêu chuẩn của WHO TRS No. 978, 2013 [14;16;18].
- Kết quả kiểm tra phát hiện Mycoplasma trong ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B sau khi đóng ống bằng phương pháp PCR với cặp mồi tổng hợp k ch thước 1500 bp gene 16S rDNA cho kết quả âm tính và tương đồng với nghiên cứu của các tác giả (Audrey Jean et al. pone.0172358
February 22, 2017), (Frydenberg et al . The sequence of 16S rRNA from mycoplasma strain PG50. DNA 4:127-137). Từ kết quả trên cho thấy ngân hàng tế
bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18 đạt yêu cầu về kiểm tra Mycoplasma [49].
- Kiểm tra các tác nhân ngoại lai ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01- 18A trên in vivo gồm (chuột nhắt trắng trưởng thành, chuột lang và trứng gà phôi 10-11 ngày tuổi cho kết quả không phát hiện tác nhân ngoại lai và (vi rút và vi khuẩn) gây bệnh lây nhiễm trong quá trình nuôi cấy và đóng ống cho kết quả như (bảng 3.5). Từ kết quả trên cho thấy ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A đạt yêu theo tiêu chuẩn của WHO [38;42].
- Kết quả kiểm tra vi khuẩn lao trong tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B bằng phương pháp nhuộm Zielh-Neelsen phát hiện trực khuẩn lao đặc hiệu khi quan sát trên kính hiển vi quang học cho kết quả như bảng 3.6) cho kết quả âm t ch, đạt tiêu chuẩn theo qui dịnh của WHO TRS No 978, 2015.
4.4. Tính ổn định của ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B khi bảo quản theo thời gian tại nhiệt độ tối ƣu -700C NICVB-WCB01-18B khi bảo quản theo thời gian tại nhiệt độ tối ƣu -700C
Tính ổn định của ngân hàng mẫu chuẩn tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B được xác định bằng cách kiểm tra độ sống các ống tế bào sau khi sản xuất ở điều kiện bảo quản -700 trong môi trường ni tơ lỏng. Chất lượng
của ngân hàng mẫu chuẩn được thể hiện qua đồ thị xu hướng kết quả độ sống tế bào. Khi phân t ch xu hướng các chỉ số định lượng, theo qui định của WHO TRS No, 978 và nhiều nhà sản xuất cũng như cơ quan kiểm định quốc gia trên thế giới tính ổn định (hạn dùng) của ngân hàng mẫu chuẩn phải đạt thời gian 10- năm.
Vùng ngoài khoảng (GM ± 2SD) là vùng cảnh báo. Nếu có điểm rơi vào vùng này cũng phải tìm nguyên nhân để khắc phục phòng ngừa.
Các số liệu được kết quả đánh giá t nh ổn định ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B tại (bảng 3.7 và 3.8 và (hình 3.5 và 3.6) thể hiện được rõ sự ổn định khi bảo quản ở điều kiện tối ưu theo thời gian sau sản xuất 3; 6; 12 tháng là (NICVB-MCB01-18A: 2,05; 2,15; 2,09 và NICVB- WCB01-18B: 2,11; 2,06; 1,98) các kết quả đều nằm trong khoảng giới hạn (GM ± 2 SD) và đạt yêu cầu ≥ 9 % so với độ sống sau khi sản xuất là 2 x 106 tế bào/ống/ml tương đương ≥ 1,8 x1 6 tế bào/ống/ml). Không có điểm nào rơi vào giới hạn cảnh báo và giới hạn hành động và không có sự khác biệt có nghĩa thống kê về giá trị độ sống tế bào vero tại các thời điểm đánh giá theo thời gian [6;10;14; 16;18;20;37]. Như vậy ngân hàng tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB-WCB01-18B đạt yêu cầu về tính ổn định khi bảo quản ở điều kiện tối ưu nhiệt độ -700C trong ni tơ lỏng theo thời gian.
KẾT LUẬN
Qua kết quả nghiên cứu về đánh giá chúng tôi có các kết luận như sau:
1. Ngân hàng mẫu chuẩn tế bào vero 76 NICVB-MCB01-18A và NICVB- WCB01-18B được sản xuất đạt tiêu chuẩn theo quy định WHO TRS No.932, phần 3, 2006 cho một sản phẩm mẫu chuẩn.
. Quy trình chuẩn SOP đánh giá chất lượng tế bào vero dùng cho kiểm định vắc xin và sinh phẩm y tế đạt các chỉ tiêu về tiêu chuẩn chất lượng theo khuyến cáo