Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Điều tra hiện trạng bệnh chảy gôm thối gốc trên cây cam, quýt Bắc Kạn tại huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn Kạn tại huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn
Điều tra hiện trạng sản xuất cây cam quýt Bắc Kạn.
Điều tra, ghi nhận hiện trạng, diễn biến bệnh chảy gôm thối gốc trên cây cam, quýt Bắc Kạn.
Điều tra tình hình bệnh, xác định đối tượng gây hại chính bệnh chảy gôm cây cam, quýttại huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn.
3.4.2. Xác đinh nguyên nhân gây bệnh chảy gôm thối gốc trên cây cam quýt Bắc Kạn Bắc Kạn
Thu thập mẫu bệnh, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh chảy gôm thối gốcở vùng trồng cam, quýt thuộc huyện Bạch Thông, tỉnh Bắc Kạn.
Tìm hiểu diễn biến của bệnh nấm Phytopthora spp.trên cây cam quýt. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học của loài nấm Phytopthora
3.4.3. Nghiên cứu và thử nghiệm các thuốc hóa học trừ bệnh chảy gôm thối gốc trên cây cam, quýt Bắc Kạn trong điều kiện invitro gốc trên cây cam, quýt Bắc Kạn trong điều kiện invitro
Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học phòng trừ nấm hại gây bệnh chảy gôm thối gốc trên cây cam, quýt Bắc Kạn trong điều kiện invitro.
3.4.4. Nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với nấm hại gây bệnh.
Nghiên cứu sự phát triển của nấm trong môi trường có chứa vi khuẩn đối kháng.
3.4.5. Nghiên cứu khả năng ức chế của dịch chiết địa y đối với nấm
Phytophthora spp.
Nghiên cứu sự phát triển của nấm trong môi trường có chứa dịch chiết địa y.
3.4.6. Nghiên cứu khả năng ức chế sinh bọc động bào tử của dịch chiết địa y và thuốc hóa học đối với nấm Phytophthora spp. và thuốc hóa học đối với nấm Phytophthora spp.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Điều tra hiện trạng bệnh thối gốc trên cây cam quýt tại Bắc Kạn
Điều tra hiện trạng sản xuất cây cam quýt tại Bắc Kạn. Thu thập số liệu thống kê của xã, huyện.
Điều tra trực tiếp trên các vườn trồng cam và phỏng vấn nông dân. Điều tra, ghi nhận hiện trạng, bệnh chảy gôm thối gốc trên cây cam quýt tại
Bắc Kạn.
Điều tra: theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại trên cây ăn quả có múi (QCVN 01-119:2012/BNNPTNT) của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2012.
Điều tra ở các 3 vùng trồng cam quýt chủ yếu của huyện Bạch Thông gồm Quang Thuận, Dương Phong, Đôn Phong. Mỗi vùng điều tra 5 vườn, mỗi vườn điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 3 cây. Đánh giá tỉ lệ bệnh, chỉ số bệnh trên các vườn, các độ tuổi cây, các thời điểm phát triển của cây,....
Điều tra bổ sung: điều tra khi cây ra lộc, ra hoa, ra quả hoặc theo từng đợt sâu bệnh hại phát sinh trên các vườn cam.
Chọn vùng điều tra bổ sung: ngoài vùng điều tra chính, chọn các vùng phụ để điều tra bổ sung theo thời kỳ sinh trưởng của cây (cây ra lộc, ra hoa, ra quả, giai đoạn chín...); theo mùa vụ trong năm (mùa mưa, mùa khô).
3.5.2. Xác đinh nguyên nhân gây bệnh chảy gôm thối gốc cam quýt Bắc Kạn
Thu mẫu theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại trên cây ăn quả có múi (QCVN 01-119:2012/BNNPTNT) của Bộ NN.
Thu thập mẫu các bộ phận bị bệnh của cây, mẫu đất ở các vườn cây ăn quả có múi để phân lập nấm bệnh theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (1997).
Lấy mẫu đất ở gốc của cây bị bệnh, mỗi cây điều tra 4 hố nằm trong khu vực hình chiếu của tán cây, cách mép hình chiếu tán cây 30-50 cm. Mẫu được mang về phân tích tại phòng thí nghiệm Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thông tin của mẫu thu thập gồm: + Ngày, địa điểm thu mẫu, tên chủ hộ.
+ Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây) + Bộ phận cây bị hại.
+ Điều kiện đất đai (đất đồi, đất ruộng...), các biện pháp quản lý (phân bón, thuốc bảo vệ thực vật và vệ sinh đồng ruộng...).
3.5.3. Phƣơng pháp điều chế môi trƣờng
Môi trường 20T
Thành phần: Nước cà chua Agar 20g CaCO3 3g
Nước cất 1000ml Phương pháp chuẩn bị môi trường:
Chuẩn bị 2 - 3 quả cà chua xay bằng máy say sinh tố trong 2 phút đổ ra cốc đong, lọc bằng vải mản lấy 200 ml phần dịch trong cà chua. Lấy dịch cà chua 20% nồng độ cuối rồi nước đun sôi tới 1000C. CaCO3 nghiền nhỏ cho vào nước cất vô trùng, dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan, lọc qua vải màn lấy phần dịch nước vôi trong sau đó đổ vào dịch nước cà chua rồi kiểm tra nồng độ pH từ 6 -7.
Cho dịch nước cà chua và agar, thêm đủ lượng nước cần thiết vào bình tam giác, lắc đều rồi cho vào lò vi sóng cho tan agar, sau đó cho bọc giấy bạc rồi đem
hấp khử trùng ở áp suất 1,5 atm, nhiệt độ 1210C trong 30 - 45 phút. Sau đó để nguội xuống 550C tiến hành đổ ra đĩa petri để nuôi cấy nấm.
Môi trường 10S
Thành phần: Đậu tương 60g Agar 20g
Nước cất 1000ml Phương pháp chuẩn bị môi trường:
Đậu tương khô ngâm qua đêm rồi rửa sạch với nước, đem đậu tương đã ngâm nghiền với 330 ml bằng máy say sinh tố, lọc bằng vải màn lấy phần dịch gốc đậu tương. Lấy dịch gốc đậu tương 10% nồng độ cuối. Cho dịch gốc đậu tương và agar, thêm đủ lượng nước cần thiết vào bình tam giác, lắc đều rồi cho vào lò vi sóng cho tan agar, sau đó cho bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở áp suất 1,5 atm, nhiệt độ 1210C trong 30 - 45 phút. Sau đó để nguội xuống 550C tiến hành đổ ra đĩa petri để nuôi cấy nấm.
Môi trường PCA Thành phần: Khoai tây 20 g Cà rốt 20 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml Môi trường chọn lọc PSM
Thành phần như môi trường PCA nhưng cho thêm 3 loại kháng sinh: Piramicin 10 ppm
Rifampicin 50 ppm Hymexazol 50 ppm
Piramicin 0,4 ml hòa vào hộp nhựa nhỏ chứa 6,7 ml nước cất vô trùng (hộp nhựa này cần được bọc kín vì khi hóa chất này tiếp xúc với ánh sáng sẽ bị phân hủy và mất hiệu lực).
Rifampicin 0,05g hòa vào hộp nhựa chứa 6,7 ml Methanol. Hymexazol 0,05g hòa vào hộp nhựa chứa 6,7 ml nước cất vô trùng.
Môi trường PDA
Thành phần: Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
Cách điều chế môi trường PDA: khoai tây rửa sạch, cân đủ lượng cần dùng (200 g), thái thành từng miếng nhỏ đun với lượng nước cất đã tính đến sôi trong thời gian 20 phút. Đổ ra gạn lấy dịch trong, thêm cho đủ lượng nước (1000 ml) vào bình tam giác rồi cho 20 g đường glucose và 20 g agar khuấy đều, cho vào lò vi sóng đun cho đến khi tan hết agar. Dùng giấy bạc đậy lại nắp bình, cho bình tam giác chứa môi trường hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C (tương đương với áp suất 1.5 atm) trong vòng 30 - 45 phút.
Các môi trường khác cũng điều chế tương tự.
Riêng kháng sinh, sau khi môi trường hấp khử trùng xong để nguội khoảng 55 - 600C rồi mới cho kháng sinh vào. Sau đó rót môi trường ra các đĩa petri đã được hấp khử trùng ở 1210
C, áp suất 1,5 atm trong 30 - 45 phút hoặc đã được sấy ở 1600
C trong 3 giờ, rót mỗi đĩa dày khoảng 5 mm.
3.5.4. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh
Theo phương pháp điều tra cơ bản, thu thập và xác định hình thái VSV gây hại theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I của Viện BVTV ấn hành 1997.
Sử dụng phương pháp phân lập, nuôi cấy tác nhân gây bệnh trên môi trường PDA và xác định đặc điểm hình thái, bào tử nấm trên kính hiển vi.
Phương pháp phân lập nấm Phytophthora spp. theo phương pháp
Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996)
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Nấm Phytophthora mọc trên môi trường
giàu Carbonhydrate, amino acids và khoáng chất, thông thường là dạng gen thạch agar. Môi trường hay dùng là: cà rốt - agar, Khoai tây - dextrose agar, cà chua - agar, đậu tương - agar, PSM. Các chất kháng sinh như Piramicin 10 ppm, Rifampicin 50 ppm, Hymexazol 50 ppm có thể cho thêm vào để diệt các loại nấm phụ sinh khác ngoài Phytophthora.
Phương pháp chuẩn đoán nhanh sự hiện diện của nấm Phytophtora từ đất bằng bẫy cánh hoa hồng
Thu thập mẫu đất ở gốc của cây bị bệnh.
Hòa đất vào nước cất vô trùng trong cốc với tỷ lệ 1 phần đất : 2 phần nước. Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để đất lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm).
Cắt cánh hoa có màu sắc 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên. Để cốc bẫy bào tử qua đêm ở nhiệt độ 20-250
C.
Quan sát cánh hoa sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày. Khi thấy cánh hoa bị mất màu đem lên kinh hiển vi soi, quan sát thấy bào tử nấm Phytophthora
Làm thuần cánh hoa đem cấy lên môi trường: PSM, PCA, PDA...
Phương pháp phân lập nấm Phytophthora spp. trên môi trường chọn
lọc PSM.
Chọn mô bệnh có triệu chứng điển hình, mới. Rửa mô bệnh sạch đất cát dưới vòi nước. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp.
Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 1%. Thời gian khử trùng từ 1/2 - 3 phút tuỳ vật liệu cây.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng.
Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng.
Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ).
Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường PSM. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây…Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp.
Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PCA, PDA, 20T, 10S. Toàn bộ việc phân lập được tiến hành trong điều kiện vô trùng và cách ly trong tủ cấy.
3.5.5. Phƣơng pháp kích thích sinh bọc bào tử (Sporangia)
Dung dịch kích thích sinh bào tử: Nước hồ đã hấp khử trùng. Nước cất đã hấp khử trùng.
Dịch chiết đất vô trùng: Dịch chiết đất được chuẩn bị như sau lấy 10 g đất ở những nơi không trồng cây cam quýt hoà với 1 lít nước, để lắng sau 1 ngày, cho vào li tâm lấy dịch trong, sau đó đổ nước vào lọ đem hấp khử trùng.
Phương pháp kích thích sinh bọc bào tử:
Cấy các mẫu nấm Phytophthora spp. trên môi trường PDA trong 5 - 7 ngày, dùng dao cấy đã khử trùng cắt vào đĩa nấm thành những mẩu nhỏ và chuyển sang đĩa petri mới đã hấp khử trùng (10 mẩu/đĩa).
Đổ các dung dịch kích thích trên vào đĩa (20 ml/đĩa). Các đĩa được ủ trong tủ ở 250C để hình thành bọc động bào tử. Theo dõi sự hình thành bọc động bào tử ở các đĩa có những dung dịch kích thích khác nhau.
Chỉ tiêu theo dõi: số bọc động bào tử ở rìa mẩu nấm/quang trường.
3.5.6. Phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo
3.5.6.1. Phương pháp lây bệnh nhân tạo trên cây bằng cách đặt các mảnh môi trường nuôi cấy chứa nấm vào gốc cây
Cây cam được trồng vào chậu đất đã phơi nắng 3 ngày. Tạo một rãnh nông sâu 2cm, cách gốc 1 cm.
Cho các mảnh môi trường nuôi cấy chứa nấm vào gốc cây (6 viên/gốc) vào rãnh đã tạo sau đó phủ đất quanh gốc, sau đó tưới đẫm nước 3 ngày liên tục.
Thí nghiệm có 4 công thức 20 cây, mỗi công thức nhắc lại 5 lần.
3.5.6.2. Phương pháp tái phân lập để xác định nguồn bệnh bằng cách lấy rễ cây lây bệnh nhân tạo đặt vào môi trường chọn lọc PSM
Cây sau khi lây bệnh nhận tạo rửa sạch sẽ rễ, lấy các rễ thâm đen trên cây đã lây bệnh đặt vào môi trường chọn lọc nấm Phytophthora (PSM) để xác định chính xác nguồn bệnh.
3.5.7. Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế sinh bào tử của thuốc hóa học và dịch chiết địa y đối với nấm Phytophthora spp.
Cấy các mẫu nấm Phytophthora sp. trên môi trường chọn lọc PSM trong 5 - 7 ngày, dùng dao cấy đã khử trùng cắt vào đĩa nấm thành những mẩu nhỏ và chuyển sang đĩa petri mới đã hấp khử trùng (2 mẩu/đĩa). Đổ các dung dịch chiết địa y và các thuốc hóa học vào đĩa (6 ml/đĩa). Theo dõi khả năng ức chế sinh bào tử của thuốc hóa học và dịch chiết địa y đối với nấm Phytophthora sp. với các dịch chiết địa y và thuốc hóa học khác nhau.
3.5.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn và nấm đối kháng với nấm gây bệnh
Các mẫu vi khuẩn đối kháng sẵn có được kiểm tra hoạt tính đối kháng với nấm bệnh bằng phương pháp đồng nuôi cấy vi khuẩn và nấm bệnh trên đĩa môi trường PDA theo như mô tả của Kumar et al. (2012). Các mẫu vi khuẩn được cấy vạch trên bề mặt đĩa thạch với khoảng cách 2,5 cm xung quanh hai bên so với tâm đĩa. Sau 2 ngày, nấm bệnh được cấy vào tâm đĩa bằng mẩu thạch với đường kính 3 mm. Đĩa không cấy vi khuẩn được coi là đĩa đối chứng (các đĩa thí nghiệm đều có đường kính 90 mm). Các đĩa thí nghiệm được ủ tại 28 ± 1 oC. Mỗi mẫu vi khuẩn được thử nghiệm được coi là một công thức và được nhắc lại 3 lần. Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn được theo dõi hàng ngày và số liệu được ghi nhận khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa. Hiệu lực ức chế nấm bệnh được đánh giá theo công thức của Kumar et al. (2012); Walker et al. (1998).
Hiệu lực ức chế nấm = 100 x (C - T)/C (%), với C là đường kính của tản nấm đối chứng (mm), T là đường kính của tản nấm thí nghiệm (mm). Hiệu lực đối kháng của vi khuẩn với nấm bệnh được xử lí bằng phần mềm IRRISTAT 5.0 và Microsoft Excel 2010.
3.5.9. Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả thuốc trong phòng thí nghiệm theo phƣơng pháp của Uesugi Yasuhiko (1997)
Thử thuốc trong phòng thí nghiệm với 3 loại thuốc khác nhau với 2 nồng độ thuốc khác nhau.
Môi trường thử thuốc: Cân thuốc theo lượng đã tính phù hợp với nồng độ cần pha (nồng độ khuyến cáo trên bao bì) để thuốc vào trong bình tam giác hay ống đong có định mức, đổ nước cất vô trùng theo lượng cần để tạo dung dịch mẹ
có nồng độ xác định. Từ dung dịch mẹ hút lượng cần lấy cho vào môi trường đã để nguội ở 550C. Mỗi loại thuốc có 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 1 đĩa petri.
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm trung bình (mm) sau cấy 1 - 7 ngày.
3.5.10. Phƣơng pháp tính toán và xử lý số liệu
Công thức tính tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%) Số cây bị bệnh
+ Tỷ lệ bệnh (%) = --- × 100 Tổng cây điều tra
n1 + 3n3 + 5n5 + 7n7 +9n9
+ Cấp bệnh trung bình = --- × 100 N
Trong đó:
N là tổng số cây bị bệnh, n1,n2,...nn: Số cây bị bệnh mỗi cấp
* ấp ệnh
Cấp 1 Có vết bệnh nhỏ trên thân
Cấp 3 Có vài vết bệnh thân với chiều rộng của vết bệnh chiếm < 20 % chu vi vòng thân (cành)
Cấp 5 Vết bệnh trên thân (cành) có chiều rộng chiếm ≥ 20 - <50% chu vi vòng thân (cành)
Cấp 7 Vết bệnh trên thân (cành) có chiều rộng chiếm từ ≥ 50 - <75% chu vi vòng thân (cành)
Cấp 9 Vết bệnh trên thân (cành) có chiều rộng chiếm từ ≥ 75% chu vi vòng thân (cành) trở lên
Chú ý: chu vi thân (cành) được đo tại vị trí vết bệnh có chiều rộng lớn nhất * Mức độ phổ biến của bệnh hại được đánh giá theo thang 4 cấp:
+ : Tỷ lệ cây bị bệnh trên đồng ruộng từ 1 - 10% ++: Tỷ lệ cây bị bệnh trên đồng ruộng từ 11 - 20% +++: Tỷ lệ cây bị bệnh trên đồng ruộng từ 21 - 50%