PHYTOPHTHORANICOTIANAE P2
4.3.1. Ả và hình thái ả
Môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của nấm bệnh. Nấm Phytophthora cũng như các loài vi sinh vật khác chỉ tồn tại khi có các ký chủ thích hợp hay được cung cấp nguồn thức ăn. Để tìm hiểu về sự ảnh hưởng của môi trường đến sự sinh trưởng của nấm, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy 2 nấm Pythium P1 và Phytophthora nicotianae P2 trên 4 môi trường khác nhau. Kết quả thí nghiệm nuôi cấy trên 4 môi trường dinh dưỡng của Pythium
Khi nuôi cấy nấm Pythium P1, Phytophthora nicotianae P2 trên 4 môi trường PDA, PCA, T20, S10, chúng tôi thấy nấm Pythium P1: môi trường PCA thuận lợi nhất cho sự sinh trưởng của nấm, sau 5 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm đã mọc kín đĩa. Trên các môi trường còn lại nấm sinh trưởng tương đương nhau; nấm Phytophthora nicotianae P2 các môi trường PDA, PCA, T20 nấm sinh trưởng tương đương nhau, sau 6 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm mọc kín đĩa còn trên môi trường S10 nấm phát triển kém nhất.
Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Pythium P1 và Phytophthoranicotianae P2
Ngày theo dõi
Đƣờng kính tản nấm trung bình ( mm )
Pythium P1 Phytophthoranicotianae P2
PDA PCA 20T 10S PDA PCA 20T 10S
1 12 14 14 9 21 19 18 14 2 48 44 45 43 37 37 35 22 3 64 60 61 55 53 53 54 29 4 84 75 77 69 67 70 65 36 5 88 90 89 82 81 84 76 43 6 90 90 90 90 90 90 59 Chú thích: Thí nghiệm ở nhiệt độ phòng 200C - 250C
Đường kính đĩa petri 90 mm.
Hình 4.8. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Hình 4.9. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Phytophthora nicotianae P2
Trên mỗi loại môi trường, nấm có sự sinh trưởng khác nhau, do đó hình dạng và màu sắc của tản nấm trên mỗi loại môi trường cũng khác nhau, sự khác nhau đó được trình bày ở bảng 4.11 và bảng 4.12, hình 4.10 và hình 4.11.
Bảng 4.11. Đặc điểm hình thái tản nấm Pythium P1trên một số môi truờng nuôi cấy
STT Môi trƣờng Hình dạng tản nấm Màu sắc môi trƣờng
Màu săc tản nấm
1 PDA Tản nấm trắng,
bông xốp, mịn. Màu trắng trong. Màu trắng. 2 PCA Tản nấm mọc thưa,
hơi bông xốp. Màu trắng. Màu trắng. 3 20T Tản nấm bông xốp,
mịn. Màu vàng nhạt. Màu trắng 4 10S Tản nấm mọc thưa, Màu trắng đục Màu trắng.
hơi bông xốp
Hình 4.10. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Pythium P1
Bảng 4.12. Đặc điểm hình thái tản nấm Phytophthoranicotianae P2trên một số môi truờng nuôi cấy
STT Môi trƣờng Hình dạng tản nấm Màu sắc môi trƣờng Màu sắc tản nấm 1 PDA Tản nấm trắng,
bông xốp, mịn. Màu trắng trong. Màu trắng. 2 PCA Tản nấm trắng, bông xốp. Màu trắng. Màu trắng. 3 20T Tản nấm bông xốp, mịn. Màu vàng nhạt. Màu trắng 4 10S Tản nấm mọc thưa, hơi
Hình 4.11. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Phytophthora nicotianae P2
4.3.2. Ảnh hƣởng của các dung dịch kích thích khác nhau đến khả năng hình thành bọc động bào tử của nấm Pythium P1 và Phytophthoranicotianae P2
Phytophthora và Pythium là đối tượng gây hại trong đất và gây hại nhiều
bộ phận của cây. Nguồn nấm gây bệnh tồn tại trong đất, bào tử động sinh ra và lan truyền nhờ nước mưa, nước tưới... Sự biến động số lượng bọc bào tử thay đổi theo từng vùng và phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác. Để tìm hiểu khả năng hình thành bọc bào tử, chúng tôi đã tiến hành thử 3 loại dung dịch kích thích khác nhau trên môi trường PSM như: nước hồ vô trùng, nước cất vô trùng và dịch chiết đất vô trùng. Kết quả thí nghiệm được thể hiện dưới bảng 4.13 và hình 4.12.
Hình 4.12. Kích tích sự sinh bọc bào tử của nấm Pythium P1 và
Phytophthoranicotianae P2 trên một số dung dịch khác nhau
Bảng 4.13. Khả năng sinh bọc bào tử của nấm Pythium P1 và Phytophthora
nicotianae P2 trên một số dung dịch kích thích
STT Dung dịch kích thích Số bọc bào tử/quang trƣờng
P1 P2
1 Nước cất vô trùng. 0 7,0
2 Nước hồ vô trùng*. 0 26,0
3 Nước chiết đất vô trùng. 0 18,0
Chú thích: Mỗi dung dịch đếm 10 lần, độ phóng đại 100x. *: Nước lấy ở bốn hồ.
Hình 4.12. Hình ảnh bọc bào tử của nấm Phytophthora nicotianae P2 trên quang trƣờng
Qua bảng 4.13 chúng tôi thấy ở các dung dịch khác nhau thì số lượng bọc bào tử ở các dung dịch cũng khác nhau: ở P1 không xuất hiện bọc bào tử; đối với P2, dung dịch nước đất đất vô trùng có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh bọc động bào tử của mẫu Phytophthora nicotianae P2 nhiều nhất (26 bọc bào tử/quang trường), nước cất vô trùng kích thích sinh động bào tử kém nhất (7 bọc bào tử/quang trường).
4.3.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm Pythium P1 và Phytophthora
nicotianae P2 trên cam non thực sinh
Để kiểm tra tính gây bệnh của nấm, chúng tôi cũng thực hiện lây nhiễm 2
nấm Pythium P1 và Phytophthora nicotianae P2, P3 lên cây cam con thực sinh
bằng cách đặt các mảnh môi trường nuôi cấy chứa nấm vào gốc cây. Cây cam trồng trong chậu được đặt các mảnh môi trường nuôi cấy chứa nấm vào gốc cây sau đó tưới đẫm nước vào gốc cây. Kết quả lây nhiễm trình bày ở bảng 4.14 và hình 4.13, hình 4.14.
Kết quả lây nhiễm cho thấy sau 3 tuần, tất cả các cây lây nhiễm không chết mặc dù ở công thức lây với Phytophthoranicotianae P2 và P3, lá non của một số cây có chuyển màu vàng nhẹ.
Sau lây nhiễm 3 tuần, tất cả các cây lây nhiễm, kể cả đối chứng được kiểm tra bộ rễ. Quan sát bộ rễ cho thấy không có khác biệt nhiều giữa rễ của cây lây nhiễm và cây đối chứng.
Bảng 4.14. Lây nhiễm nhân tạo Pythium (P1) và Phytophthoranicotianae
(P2, P3) trên cây cam non thực sinh
Mẫu Số cây lây
Số cây biểu hiện triệu chứng
Triệu chứng bệnh 1 tuần 2 tuần 3 tuần
P1 5 0/5 0/5 0/5 Cây không có biểu hiện biến vàng
P2 5 0/5 1/5 3/5 Lá cây chuyển màu vàng nhẹ P3 5 0/5 1/5 2/5 Lá cây chuyển màu vàng nhẹ ĐC (không
lây nhiễm) 5 0/5 0/5 0/5
Cây sinh trưởng phát triển bình thường
Hình 4.13. Lây nhiễm nhân tạo nấm Pythium (P1), Phytophthoranicotianae
(P2, P3) trên cây cam non thực sinh. Sáu mảnh môi trƣờng chứa nấm đƣợc nhiễm và gốc cây
Để khẳng định chắc chắn, chúng tôi đã tiến hành tái phân lập rễ các cây lây nhiễm trên môi trường chọn lọc PSM. Kết quả tái phân lập được thể hiện ở bảng 4.15 cho thấy không rễ nào hình thành nấm Pythium (công thức lây P1) hay
Phytophthoranicotianae (công thức lây P2 và P3).
Kết quả này chứng tỏ cả 3 nguồn nấm lây nhiễm đều không gây bệnh trên gốc rễ cây cam non thực sinh hoặc cũng có thể trong đất trồng cây (không được khử trùng) có chứa vi sinh vật ức chế sự tồn tại và xâm nhiễm của nấm.
Bảng 4.15. Kết quả tái phân lập nấm từ rễ cây cây lây bệnh nhân tạo trên môi trƣờng PSM
Mẫu Nguồn lây Số mẩu rễ phân lập Số mẫu rễ hình thành Pythium/Phytophthora
1 P1 5 0
2 P2 5 0
3 P3 5 0
4.4. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PYTHIUM VÀ PHYTOPHTHORA
NICOTIANAE BẰNG THUỐC HÓA HỌC, VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VÀ
SẢN PHẨM CHIẾT TỪ ĐỊA Y TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO
4.4.1. Hiệu lực ức chế của thuốc hóa học đối với nấm Pythium P1 và
Phytophthoranicotianae P2 trên môi trƣờng PDA
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 3 loại thuốc: Ridomil Gold 68 WP, Nano copper, Agrifos 400 trên môi trường PDA với 2 nồng độ, các thuốc được sử dụng trong phòng thí nghiệm có nồng độ đúng với khuyến cáo trên bao bì. Nồng độ 1 (Ridomil Gold 68 WP 0,3%, Nano copper 0,19%, Agrifos 400 0,5%), nồng độ 2 (Ridomil Gold 68 WP 0,15%, Nano copper 0,095%, Agrifos 400 0,25%).
Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa Petri với 3 lần lặp lại với mỗi nồng độ của mỗi thuốc. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.16 và 4.17, Hình 4.15, 4.16 và 4.17.
Bảng 4.16.Hiệu lực ức chế của thuốc hóa học đối với nấm Pythium P1 và
Phytophthoranicotianae P2 trên môi trƣờng PDA ở nồng độ 1
Thuốc và nồng độ xử lý HLPT (%) đối với
Pythium P1 HLPT (%) với nấm Phytophthoranicotianae P2 Ridomil Gold 68 WP 0,3% 100a 100 Agrifos 400 0,5% 86,67b 100 Nano copper 0,19% 0c 100 Đ/C (không xử lý thuốc) 0c 0 CV (%) 2,10 LSD0,05 1,81
Chú thích: Hiệu lực ức chế nấm được ghi nhận khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm); Các giá trị trên bảng là trung bình của 3 lần nhắc lại; Các số liệu trong cột có các
chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thông kê (p<0,05)
Hình 4.15. Hiệu lực ức chế của thuốc hóa học đối với nấm Pythium P1 và
Phytophthoranicotianae P2 trên môi trƣờng PDA ở nồng độ 1
Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với mẫu P1 các thuốc Ridomil Gold 68 WP 0,3% và Agrifos 400 0,5% đều ức chế mạnh sinh trưởng của nấm với hiệu lực lần lượt là 100% và 86,67%, còn Nano copper 0,19% không có hiệu lực
Đối với mẫu Phytophthora P2, sử dụng thuốc hóa học rất có hiệu quả. Các thuốc Ridomil Gold 68 WP 0,3%, Agrifos 400 0,5% và Nano copper 0,19% ức chế sinh trưởng mạnh và đều có hiệu lực 100%.
Bảng 4.17.Hiệu lực ức chế của thuốc hóa học đối với nấm Pythium P1 và
Phytophthoranicotianae P2 trên môi trƣờng PDA ở nồng độ 2
Thuốc HLPT (%) đối với
Pythium P1 HLPT (%) với nấm Phytophthoranicotianae P2 Ridomil Gold 68 WP 0,15% 100a 100 Agrifos 400 0,25% 52,96b 100 Nano copper 0,095% 0c 100 Đ/C (không xử lý thuốc) 0c 0 CV (%) 3,00 LSD0,05 2,18
Chú thích: Hiệu lực ức chế nấm được ghi nhận khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm); Các giá trị trên bảng là trung bình của 3 lần nhắc lại; Các số liệu trong cột có các
chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thông kê (p<0,05)
Hình 4.16. Hiệu lực ức chế của thuốc hóa học đối với nấm Pythium P1 và
Phytophthoranicotianae P2 trên môi trƣờng PDA ở nồng độ 1
Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm P1: thuốc Ridomil Gold 68 WP 0,15% rất có hiệu quả trong phòng trừ nấm Pythium P1 và có hiệu lực phòng trừ 100%, Agrifos 400 0,25% có hiệu lực phòng trừ 52,96% còn Nano copper 0,095% không có hiệu lực phòng trừ đối với nấm Pythium P1; Đối với nấm Phytophthora
nicotianae P2 sử dụng thuốc hóa học rất có hiệu quả trong phòng trừ bệnh do
nấm PhytophthoranicotianaeP2, các thuốc Ridomil Gold 68 WP 0,15%, Agrifos
400 0,25% và Nano copper 0,095% ức chế sinh trưởng và đêu có hiệu lực 100%.
Hình 4.17. Hiệu lực ức chế của nấm Phytophthora nicotianaeP2 đối với một số thuốc hóa học qua 2 nồng độ
A) Nồng độ 1. B) Nồng độ 2. 1) Đối chứng. 2) Agrifos 500. 3) Nano copper. 4) Ridomil Gold 68 WP
4.4.2. Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng đối với nấm Phytophthora
nicotianaeP2 trên môi trƣờng PDA
Việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng có nguồn gốc trong đất được coi là biện pháp hiệu quả nhất để phòng trừ các tác nhân gây bệnh cây truyền qua đất.
Trong nghiên cứu này, ba mẫu vi khuẩn đối kháng sẵn có được kí hiệu là DN1, VT2 và QN4 đã được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của mẫu Phytophthora P2 gây bệnh chảy gôm trên cây có múi trong điều kiện in-vitro.
Kết quả thí nghiệm cho thấy cả ba mẫu vi khuẩn DN1, VT2 và QN4 đều ức chế mạnh sinh trưởng của nấm Phytophthora nicotianae P2 với hiệu lực lần lượt là 85,9%; 71,1% và 70,4%. Trong đó, hiệu lực ức chế nấm của hai mẫu vi khuẩn VT2 và QN4 sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (Bảng 4.18, Hình 4.18).
Bảng 4.18. Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng đối với nấm
Phytophthora nicotianae P2 trên môi trƣờng PDA
Mẫu vi khuẩn* Hiệu lực ức chế sinh trƣởng (%)
DN1 85,9a
VT2 71,1b
QN4 70,4b
Chú thích: *Mẫu vi khuẩn sẵn có tại Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới; Hiệu lực ức chế nấm được ghi nhận khi tản nấm đối chứng mọc kín đĩa môi trường PDA (đường kính 90 mm); Các giá trị trên
bảng là trung bình của 3 lần nhắc lại; Các số liệu trong cột có các chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thông kê (p<0,05); LSD 5%=2,93.
4.4.3. Hiệu lực ức chế của sản phẩm chiết địa y đối với nấm Phytophthora
nicotianaeP2 trên môi trƣờng PDA
Trong lĩnh vực phòng chống sinh học bệnh cây, nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ nhiều loài địa y chứa các hợp chất ức chế nấm và vi sinh vật giống nấm gây bệnh cây. Tuy nhiên cho tới nay, chưa có một công bố nào trên thế giới sử dụng địa y để phòng chống Phytophthora.
Trong nghiên cứu này, các sản phẩm chiết địa y do bộ môn Hóa (Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả ức chế sinh trưởng Phytophthora gây bệnh chảy gôm cây có múi. Ba loài địa y được sử dụng gồm Parmotrema tinctorum, Usnea sp. và Parmotrema sancti - angelii. Ba dung môi được sử dụng để chiết các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp từ địa y gồm methanol, acetone và hexan. Các công thức sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được chiết từ 3 dung môi bao gồm:
1. PT-methanol: Parmotrema tinctorum chiết bằng methanol 2. PT-acetone: Parmotrema tinctorum chiết bằng acetone 3. PT-hexan: Parmotrema tinctorum được chiết bằng hexan 4. US-methanol: Usnea sp. được chiết bằng methanol 5. US-acetone: Usnea sp. được chiết bằng aceton 6. US-hexan: Usnea sp. được chiết bằng hexan
7. PS-acetone: Parmotrema sancti-angelii được chiết bằng acetone 8. Đối chứng: không xử lý.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.19 và Hình 4.19.
Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các sản phẩm chết từ 3 loài địa y đều có khả năng ức chế sinh trưởng mẫu nấm Phytophthora nicotianae P2. Trong số 7 sản phẩm chiết thí nghiệm, 3 sản phẩm chiết từ loài Parmotrema tinctorum có khả năng ức chế rất cao, với hiệu lực ức chế từ 44,4 % đến 84,7% (sau 4 ngày). Tương tự, 3 sản phẩm chiết từ loài Usnea sp. cũng có khả năng ức chế rất cao, với hiệu lực ức chế từ 66,7 đến 76,0% (sau 4 ngày). Khả năng ức chế kém nhất là từ sản phẩm chiết bằng acetone của loài Parmotrema sancti-angelii với hiệu lực ức chế chỉ đạt 10,4 % (sau 4 ngày).
Bảng 4.19. Hiệu lực ức chế sinh trƣởng của các sản phẩm chiết địa y đối với
nấm Phytophthora nicotianae P2 trên môi trƣờng PDA
(nồng độ xử lý 100 ppm)
STT Công thức
Đƣờng kính tản nấm (mm) Hiệu lực ức chế sinh trƣởng ở 4
ngày (%)
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày
1 PT-methanol 0,0 0,0 9,0 12,0 75,0 2 PT-acetone 0,0 0,0 2,3 7,3 84,7 3 PT-hexan 0,0 0,0 13,0 26,7 44,4 4 Us-methanol 6,0 6,7 7,3 11,7 75,7 5 Us-aceton 6,0 6,0 7,0 11,5 76,0 6 Us-hexan 6,3 7,3 10,0 16,0 66,7 7 Ps-aceton 10,7 22,3 33,0 43,0 10,4 8 Đ/C 13,0 23,0 36,5 48,0 0,0
Hình 4.19. Hiệu lực ức chế sinh trƣởng của các sản phẩm chiết địa y đối với
nấm Phytophthoranicotianae P2 trên môi trƣờng PDA
(nồng độ xử lý 100 ppm). Đƣờng kính tản (mm) đƣợc tính từ 3 lần nhắc lại. Thanh Bar là độ lệch chuẩn.
Hình 4.20. Hiệu lực ức chế sinh trƣởng của các sản phẩm chiết địa y đối với
nấm Phytophthora nicotianae P2 trên môi trƣờng PDA
(nồng độ xử lý 100 ppm)
4.4.4. Đánh giá khả năng ức chế sinh bào tử của sản phẩm chiết địa y đối với
nấm PhytophthoranicotianaeP2
Trong thí nghiệm, khả năng ức chế sinh bào tử của 7 sản phẩm chiết địa y đối với nấm Phytophthoranicotianae P2 đã được đánh giá. Các viên môi trường