Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp thu thập mẫu ký sinh trùng
Các mẫu cơ cá được cắt thành các lát mỏng và ép trên lam kính. Quan sát phát hiện myxosporea dưới kính hiển vi. Các mẫu có nhiễm myxosporea được bảo quản trong cồn 70%.
Mật được tách riêng từ gan, sau đó chúng được đặt lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi. Các mẫu có nhiễm myxosporea được cố định làm tiêu bản và phần còn lại được bảo quản trong cồn 70%.
Các mẫu được đặt lên lam kính có phủ lamen rồi quan sát dưới kính hiển vi. Đối với các mẫu mật thì nhỏ giọt dung dịch mật lên lam kính sau đó phủ lamen rồi quan sát dưới kính hiển vi. Đối với các mẫu cơ thì đặt một lát cơ nhỏ lên lam kính, sau đó ép thành một lớp mỏng, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi.
3.5.3. Nhuộm Hematoxylin - Eosin
Dung dịch nhuộm Hematoxylin được chuẩn bị theo phương pháp của Mayer:
- Hematoxylin crystals (C16H14O6.6H2O) 4 g
- Sodium iodinate (NaIO3) 0,8g
- Potassium aluminum sulfate (Kal(SO4)2) 100g
- Citric acid (C6H8O7) 4g
- Chloral hydrate (C2H3Cl3O2) 200g
- Nước cất 2000ml
Trong quá trình chuẩn bị dung dịch nhuộm, để làm tan Hematoxylin trong nước cất thì có thể đun cách thủy 100oC trong 5 phút. Sau đó thêm Potassium aluminum sulfate và lắc cho đến khi tan hoàn tồn. Khi muối tan thì thêm Sodium iodate, tiếp theo đó là Citric và Chloral hydrate.
Dung dịch nhuộm Eosin được chuẩn bị theo phương pháp của Mayer:
- Eosin Y.Cl. 45380 (C20H6Br4Na2O5) 10g
- Nước cất 1000ml
Cách pha: Hịa tan Eosin trong nước cất có thể sử dụng máy gia nhiệt để chúng tan hồn tồn trong nước. Sau đó thêm Glacial acetic acid vào.
Các bước thực hiện: phiến mô đã được sấy khô đặt vào giá thủy tinh và lần lượt nhúng vào các dung dịch theo bảng 3.2.
Bảng 3.2. Quy trình nhuộn Hematoxylin - Eosin
Số thứ tự các bước Dung dịch Thời gian
1 100% Xylene I 2 - 3 phút 2 100% Xylene II 2 - 3 phút 3 100% Alcohol I 2 - 3 phút 4 100% Alcohol II 2 - 3 phút 5 95% Alcohol 2 - 3 phút 6 70% Alcohol 2 - 3 phút
7 Để dưới vòi nước chảy 2 - 3 phút
8 Hematoxylin 4 - 8 phút
9 Nhúng nhanh 1 - 3 giây
10 Để dưới vòi nước chảy 4 - 6 phút
11 Eosin 5 - 10 phút 12 Nhúng nhanh II 1 - 3 giây 13 75% Alcohol 2 - 3 phút 14 95% Alcohol 2 - 3 phút 15 100% Alcohol I 2 - 3 phút 16 100% Alcohol II 2 - 3 phút 17 Xylen I 2 - 3 phút 18 Xylen II 2 - 3 phút 19 Phủ nhựa Canada 3.5.4. Phân tích hình thái học
Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi Olympus CH-40 ở độ phóng đại 1.000 lần. Đo kích thước, chụp ảnh và vẽ myxosporea bằng phần mềm Illustrator CS2.
Phương pháp định loại dựa theo khóa phân loại của Lom and Diková (1992) và theo khóa định loại của Fiala et al. (2015a).
Kích thước myxosporea được đo theo phương pháp của Lom and Diková (1992) (hình 3.1).
Hình 3.1. Các số đo cần thiết để định loại ký sinh trùng myxosporea Nguồn: Lom and Diková (1992) Nguồn: Lom and Diková (1992) A và B: Myxobolus ở phía trước và ở phía bên; C và D: Henneguya ở phía trước và phía bên; E và F: Myxidium ở phía trước và phía bên; G và H: Chloromyxum ở mặt bên hoặc từ phía đường nối (G) và phía trước (H); I: Kudoa từ phía đỉnh; J: Kudoa ở một trong những điểm phụ có thể là một đường chéo. L:
chiều dài của các bào tử, W: độ rộng của các bào tử, T: độ dày của các bào tử; AL: chiều dài của phụ đuôi, TL: tổng chiều dài của bào tử.
3.5.5. Phương pháp phân tích DNA
3.5.5.1. Phương pháp tách chiết DNA
Mẫu myxosporea được tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Tisue Kit (QIAgen) theo quy trình của nhà sản xuất:
1. Cho 200mg mẫu có chứa các bào tử myxosporea vào trong ống eppendorf
UV-crosslinked 1.5mL.
2. Cho thêm 180 µl buffer ATL, 20 µl Proteinase K vào ống có chứa mẫu mơ tách chiết ở bước 1 và đậy nắp. Trộn đều bằng Vortex trong 15 giây. 3. Ủ mẫu ở 56ºC trong 3 tiếng hoặc qua đêm.
4. Lấy mẫu ra khỏi máy ủ, vortex nhẹ; thêm 200 µl buffer Al và vortex. 5. Ủ mẫu ở 70ºC trong 10 phút.
6. Thêm 200 µl cồn tuyệt đối và chuyển toàn bộ dung dụng này lên cột spin. 7. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ chạy qua.
8. Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dung dịch chạy qua.
9. Thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm ở 13000 rpm trong 3 phút, loại bỏ dung dịch chạy qua.
10. Đặt cột spin lên ống ống eppendorf UV-crosslinked 1.5mL, thêm 200 µl đệm AE. Để trong 1 phút và ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút. Dung dịch thu được có chứa DNA tổng số.
3.5.5.2. Phương pháp PCR
Nhân bản trình tự DNA của đoạn SSU rDNA (Small subunit ribosomal DNA - 18S) của các mẫu myxosporea bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi 18e (5’-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3’)-Kud6R (5’-TCCAGTAGCTACTCATCG- 3’) và Kud6F (5’-TCACTATCGGAATGAACG-3’) - 18g (5´- GGTAGTAGCGACGGGCGGCGTG-3´) (Hillis and Dixon, 1991; Whipps et
al., 2003). Thành phần phản ứng PCR gồm: H2O = 37,5 µl, Buffer = 5 µl, dNTP
= 2 µl, Primer xi và ngược = 2 µl , Template = 1,5 µl, Enzyme = 2 µl. Chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: giai đoạn khởi đầu 95oC biến tính trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu trình nhiệt 95oC/30 giây, 51oC/40 giây, 72oC/1 phút, giai đoạn cuối kéo dài 72oC trong 3 phút.
Chuẩn bị gel: cân thạch agarose hòa vào dung dịch TAE 1x. Đun trong lò vi sóng đến lúc agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến 60oC, đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã được cài sẵn lược. Sau khoảng 30 - 45 phút, khi gel đã đông cứng, tháo bỏ lược ra khỏi gel và đặt bản gel vào trong bể điện di có chứa dung dịch TAE 1X sao cho bản gel ngập trong dung dịch.
Tra mẫu: trộn sản phẩm PCR với loading buffer 6x theo tỷ lệ 4:1 rồi tra vào giếng điện di.
Điện di: điện thế dùng điện di thường từ 100 - 120V. DNA chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển màu của loading buffer để lựa chọn thời gian điện di cho phù hợp để tránh cho mẫu DNA bị chạy ra ngoài.
Nhuộm gel: bản gen chạy xong được nhuộm trong ethidium bromide 0,5µg/ml trong 15 phút có lắc nhẹ. Sau đó chúng sẽ được rửa dưới vòi nước chảy. Soi gel trên đèn UV để đánh giá sản phẩm PCR và chụp ảnh bằng máy ảnh Canon 750D.
3.5.5.3. Phương pháp phân tích số liệu
Sản phẩm PCR rõ băng vạch được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc). Dùng chương trình BLAST để so sánh mức độ tương đồng của trình tự thu được với các trình tự trên Genbank. Phân tích mối quan hệ tiến hóa phân tử của các trình tự thu được với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng phần mềm MEGA 6 theo phương pháp Neighbor Joining (Tamura et al., 2013).
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ
4.1.1. Thành phần loài trùng bào tử sợi myxosporea ở cá biển tại địa điểm nghiên cứu nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu trùng bào tử sợi myxosporea ký sinh trên cá biển đã định loại được 14 lồi thuộc 6 giống, 6 họ, 2 bộ. Trong đó, 4 lồi được phát hiện mới cho khoa học (Sphaeromyxa n.sp.1, Sphaeromyxa n.sp.2, Myxidium n.sp., Auerbachia n.sp.), 4 loài định loại đến giống (Ceratomyxa sp.1, Ceratomyxa
sp.2, Ceratomyxa sp.3, Ceratomyxa sp.4).
Thành phần loài myxosporea ký sinh được sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:
Ngành CNIDARIA Hatschek, 1888 Phân ngành MYXOZOA Grassé, 1970 Lớp MYXOSPOREA Bütschli, 1881 Bộ BIVALVULIDA Shulman, 1959
Họ SPHAEROMYXIDAE Lom and Noble, 1984 Giống Sphaeromyxa Thélohan, 1892
1. Sphaeromyxa n.sp.1 2. Sphaeromyxa n.sp.2 Họ MYXIDIIDAE Thélohan, 1892 Giống Myxidium Buetschli, 1882
3. Myxidium n.sp.
Họ CERATOMYXIDAE Doflein, 1899 Giống Ceratomyxa Thélohan, 1892
4. Ceratomyxa sp.1 5. Ceratomyxa sp.2 6. Ceratomyxa sp.3 7. Ceratomyxa sp.4
Giống Auerbachia Meglitsch, 1968 8. Auerbachia n.sp.
9. Auerbachia chakravartyi Narasimhamurti, Kalavati, Anuradha, Padma, 1990
Bộ MULTIVALVULIDA Shulman, 1959 Họ TRILOSPORIDAE Shulman, 1959 Giống Unicapsula Davis, 1924
10. Unicapsula andersenae Miller and Adlard, 2013 Họ KUDOIDAE Meglitsch, 1960
Giống Kudoa Meglitsch, 1947
11. Kudoa monodactyli Gunter, Cribb, Whipps and Adlard, 2006 12. Kudoa scomberomori Adlard, Bryant, Whipps and Kent, 2005 13. Kudoa megacapsula Yokoyama and Itoh, 2005
14. Kudoa kenti Burger and Adlard, 2009.
4.1.2. Mơ tả các lồi myxosporea ký sinh trên cá biển vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Bình Quảng Bình
Ngành CNIDARIA Hatschek, 1888 Phân ngành MYXOZOA Grassé, 1970 Lớp MYXOSPOREA Bütschli, 1881 Bộ BIVALVULIDA Shulman, 1959
Họ SPHAEROMYXIDAE Lom and Noble, 1984 Giống Sphaeromyxa Thélohan, 1892
4.1.2.1. Lồi Sphaeromyxa n.sp.1
Vật chủ: Cá Bị Paramonacanthus japonicus Nơi ký sinh: Túi mật
Nơi phát hiện: Quảng Bình, Việt Nam Tỷ lệ nhiễm: 6/15
Mơ tả:
Plasmodia: Các bào tử trôi nổi tự do trong mật. Bào tử trưởng thành có thể dễ dàng được quan sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 40x. Bào tử chưa trưởng
thành thường đi sóng đơi với nhau và được bao bọc bởi màng mỏng. Chúng thường bám vào nhau tạo thành một khối lớn chiếm một phần đáng kể trong túi mật của vật chủ.
Bào tử: Bào tử trưởng thành có hình thoi, dạng thẳng, hai đầu của bào tử thẳng, phía bên của bào tử cong. Bào tử có các đường vân chạy dọc và song song với bào tử. Bên trong bào tử có 2 nang cực to nằm ở hai đầu đối diện của bào tử. Nang cực có hình bầu dục và có kích thước bằng nhau. Bên trong mỗi nang cực có chứa sợi nang cực ngắn, cuộn gấp lại trong nang cực khoảng 2 đến 3 nếp gấp. Chất nguyên sinh nằm tập trung ở giữa khoang bào tử giữa hai nang cực (hình 4.1).
Kích thước của bào tử và nang cực được xác định dựa trên kích thước của 25 bào tử khác nhau. Bào tử dài 14,8 ± 0,4 (14,3 - 15,5) µm, rộng 4,4 ± 0,2 (4,2 - 4,7) µm, nang cực dài 4,3 ± 0,2 (3,9 - 4,7) µm, rộng 2,7 ± 0,1 (2,4 - 3) µm. So sánh với các loài khác thuộc giống Sphaeromyxa, mẫu chúng tơi thu được có đặc điểm hình thái gần với loài S. zaharoni thu từ cá Pterois miles ở Israel (bảng 4.1).
Hình 4.1. Lồi Sphaeromyxa n.sp.1
Bảng 4.1. Bảng so sánh kích thước của một số lồi trong giống Sphaeromyxa (Đơn vị đo: µm)
Lồi Chiều dài bào
tử Chiều rộng bào tử Độ dày bào tử Chiều dài nang cực Chiều rộng nang cực Vật chủ Cơ quan nhiễm Nơi phát hiện S. balbianii (13–16) 5 Gaidropsarus vulgaris Túi mật Pháp
S. bonaerensis 17,33 4,45 4,16 4,08 2,81 Anchoa marinii
Hildebrand Túi mật Argentina S. cannolii 17,6 5,7 4,8 3,0 Hippocampus erectus Ống mật Mỹ S. artedielli 17,8 5,4 5,4 7-10 1,5-2 Artediellus atlanticus Túi mật Na Uy
S. atherinae 14,4-16,8 3,6-4 4-5 2,4-3 Atherina boyeri Túi mật Nga
S. diacanthusa 20,9 5,37 5,1 3,67 Protonibea
diacanthus Túi mật ẤnĐộ
S. japonica (18,5–23,7) (4,3–4,5) (5,0–6,3)
3,8
Triglops scepticus Túi mật Nhật Bản
S. lomi 26,5
(23,0–29,0) (3,5–5,0) 4,1 (7,5–12,0) 9,8 (2,5–4,5) 3,5 Malacocephalus occidentalis Túi mật Borneo
S. magna (22,0–23,8) (5,5–6,4) Liparis gibbus Túi mật Nga
S. schulmani (18,6–20) (4–5,98 (4,65-
5,98)
(2,66–3,32) Salilota australis Túi mật Tây Nam
Đại Tây Dương S. zaharoni 14,5 (13,7–15,1) 4,8 (4,2–5,5) 4,8 (3,3–5,6) 3,4 (2,5–4,0)
Pterois miles Túi mật Israel
S. hellandi (20,8–26) 5,4 5,4 (7–10) (1,5–2) Molva molva Túi mật Na Uy
Sphaeromyxa n.sp.1 14,8 ± 0,4
4.1.2.2. Loài Sphaeromyxa n.sp.2
Vật chủ: Cá Chai Platycephalus indicus Nơi ký sinh: Túi mật
Nơi phát hiện: Quảng Bình, Việt Nam Tỷ lệ nhiễm: 2/3
Mô tả:
Plasmodia: Các bào tử và plasmodia trôi nổi tự do trong mật. Với số lượng lớn, chúng làm dung dịch mật trở nên mờ đục. Các bào tử trưởng thành có kích thước lớn và hình dạng đặc trưng của giống Sphaeromyxa (phụ lục 1). Các plasmodia có cấu trúc bao gồm các bào tử chưa trưởng thành liên kết với nhau bởi các màng bao bọc chúng tạo thành các đám plasmodia có kích thước lớn trơi lơ lửng trong dung dịch mật. Các bào tử trưởng thành nằm riêng rẽ và phân bố tự do trong dịch mật.
Hình 4.2. Lồi Sphaeromyxa n.sp.2
A-C: Mặt ngang, B-D: Mặt bên; A-B: Bào tử vẽ bằng phần mềm Illustration CS2;C-D: Bào tử tươi chụp dưới kính hiển vi
Bào tử: Bào tử trưởng thành có hình thoi, dạng thẳng vặn 180º ở hai đầu, hai đầu của bào tử phẳng, phía bên của bào tử cong. Bào tử có 6 hoặc 7 đường vân sóng chạy dọc và song song với chiều vặn của bào tử. Bên trong bào tử có 2 nang cực to nằm về hai đầu đối diện nhau của bào tử. Nang cực có dạng hình thoi thon dài và có kích thước bằng nhau. Bên trong mỗi nang cực có chứa sợi nang
cực ngắn, cuộn gấp lại một cách lỏng lẻo bên trong nang cực. Chất nguyên sinh nằm tập chung ở giữa khoang bào tử giữa hai nang cực (hình 4.2).
Kích thước của bào tử và nang cực được đo trên 40 bào tử khác nhau. Bào tử dài 20,7 ± 0,8 (19,4 - 22,1) µm, rộng 5,4 ± 0,3 (4,6 - 5,7) µm, độ dày 5,2 ± 0,3 (4,6 - 5,5) µm. Nang cực dài 7,5 ± 0,6 (6,5 - 9) µm, rộng 2,9 ± 0,2 (2,4 - 3,2) µm.
So sánh với các lồi khác thuộc giống Sphaeromyxa, mẫu chúng tơi thu được có đặc điểm hình thái gần với lồi S. tuanfengensis thu từ cá Coilia nasus ở Trung Quốc (bảng 4.2).
Phân tích phân tử 2 lồi thuộc giống Sphaeromyxa:
Chiều dài đoạn gen 18S của loài Sphaeromyxa n.sp1 và Sphaeromyxa
n.sp2 lần lượt là 1956 bp và 1967 bp. Kết quả Blast cho thấy trình tự của lồi
Sphaeromyxa n.sp1 tương đồng cao nhất (99%) với trình tự DQ377701 của lồi Sphaeromyxa hellandi ký sinh trên lồi cá Molva molva; trình tự của lồi Sphaeromyxa n.sp2 tương đồng cao nhất (99%) với trình tự KF135225 của lồi Sphaeromyxa balbianii ký sinh trên cá Gaidropsarus vulgaris.
So sánh khoảng cách di truyền của lồi Sphaeromyxa n.sp1 với trình tự của một số lồi trong cùng giống cho thấy chúng có sai khác rất lớn, sai khác ở 138 vị trí nucleotide tương đương 7,1% với trình tự của lồi Sphaeromyxa sp.
(KM201336), sai khác 163 vị trí nucleotide tương đương 8,2% với loàiSphaeromyxa lycodi (KC524734), sai khác 178 vị trí nucleotide tương đương 9,3% với trình tự của lồi Sphaeromyxa kenti (JX443489). Tương tự như vậy,
trình tự của lồi Sphaeromyxa n.sp2 sai khác 110 vị trí nucleotide tương đương
5,8% với loài Sphaeromyxa zaharoni (AY538662), sai khác 132 vị trí nucleotide tương đương 7,8% với lồi Sphaeromyxa longa (KM201344), sai khác 111 vị trí nucleotide tương đương với loài Sphaeromyxa artedielli (KF135220) và sai khác 207 vị trí nucleotide tương đương với 10,8% với trình tự của loài Sphaeromyxa kenti (JX443489). Khoảng cách di truyền giữa 2 loài Sphaeromyxa n.sp1 và
Sphaeromyxa n.sp2 là 11% (bảng 4.3).
Phân tích phân tử cho thấy Sphaeromyxa n.sp1 và Sphaeromyxa n.sp2 có quan hệ gần với 2 loài Sphaeromyxa hellandi và Sphaeromyxa balbianii (bảng 4.3, hình 4.3).Tuy nhiên, chúng lại rất khác nhau về hình thái, vật chủ và phân bố. Vì vậy, chúng tôi xác định đây là hai dạng mới cho khoa học.
Bảng 4.2. Bảng so sánh kích thước của một số lồi trong giống Sphaeromyxa (Đơn vị đo: µm)
Loài Chiều dài bào
tử Chiều rộng bào tử Độ dày bào tử Chiều dài nang cực Chiều rộng nang cực Vật chủ Cơ quan nhiễm Nơi phát hiện S. clini 18,8 5,3 5,0 5,9 2,5 Clinus acuminatus
Túi mật Nam Phi
S. ganapatii 17,5 (16,0–19,0) 4,48 (4,0–4,8) 5,6 (4,0–6,4) 1,6 (1,6–1,8) Terapon jarbua Túi mật Ấn Độ S. lycodi 22,4 (19,6–25,3) 5,7 (4,6–6,9) 5,7 (4,5–6,2) 8,32 (5,8–9,8) 3,3 (2,5–4,5) Lycodes reticulatus Túi mật Iceland S. nesogobii 21,7 (20,5–23,7) 6,6 (6,3–7,9) 7,6 (6,8–7,9) 3,2 (3,1–3,3) Nesogobius sp. Túi mật Úc S. noblei 20 (18,5–21,5) 5,6 (5,2–6) 5 (4,8–5,2) 5,9 (5–6,5) 2,6 (2,5–2,7) Heteroclinus whiteleggii Túi mật Úc S. reinhardti (21,25–23,3) (3,75–5) Engraulis mordax Túi mật Thái Bình Dương S. tuanfengensis 22,22 (20,74–23,80) 5,4 (4,76–6,80) 8,0 (6,9–8,84) 3,6 (3,0–3,9)
Coilia nasus Túi mật Trung Quốc
S. balbianii (13–16) 5 Gaidropsarus vulgaris Túi mật Pháp Sphaeromyxa n.sp.2 20,7 ± 0,8 (19,4 - 22,1) 5,4 ± 0,3 (4,6 - 5,7) 5,2 ± 0,3 (4,6 - 5,5) 7,5 ± 0,6 (6,5 - 9) 2,9 ± 0,2 (2,4 - 3,2) Platycephalus indicus Túi mật Quảng Bình, Việt Nam
Hình 4.3. Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên trình tự đoạn 18S của một số loài thuộc giống Sphaeromyxa
Bảng 4.3. Khoảng cách di truyền giữa các loài trong giống Sphaeromyxa (dựa trên phân tích trình tự gen 18S) (dựa trên phân tích trình tự gen 18S)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 0.00 2 0.11 0.00 3 0.10 0.01 0.00 4 0.09 0.12 0.12 0.00 5 0.09 0.11 0.11 0.01 0.00 6 0.04 0.11 0.10 0.09 0.08 0.00 7 0.10 0.05 0.05 0.12 0.11 0.10 0.00 8 0.08 0.11 0.11 0.06 0.07 0.08 0.11 0.00 9 0.10 0.07 0.07 0.12 0.11 0.10 0.06 0.11 0.00 10 0.09 0.05 0.05 0.11 0.10 0.10 0.05 0.10 0.03 0.00