Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.5. Phương pháp phân tích dna
3.5.5.1. Phương pháp tách chiết DNA
Mẫu myxosporea được tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Tisue Kit (QIAgen) theo quy trình của nhà sản xuất:
1. Cho 200mg mẫu có chứa các bào tử myxosporea vào trong ống eppendorf
UV-crosslinked 1.5mL.
2. Cho thêm 180 µl buffer ATL, 20 µl Proteinase K vào ống có chứa mẫu mô tách chiết ở bước 1 và đậy nắp. Trộn đều bằng Vortex trong 15 giây. 3. Ủ mẫu ở 56ºC trong 3 tiếng hoặc qua đêm.
4. Lấy mẫu ra khỏi máy ủ, vortex nhẹ; thêm 200 µl buffer Al và vortex. 5. Ủ mẫu ở 70ºC trong 10 phút.
6. Thêm 200 µl cồn tuyệt đối và chuyển toàn bộ dung dụng này lên cột spin. 7. Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ chạy qua.
8. Thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dung dịch chạy qua.
9. Thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm ở 13000 rpm trong 3 phút, loại bỏ dung dịch chạy qua.
10. Đặt cột spin lên ống ống eppendorf UV-crosslinked 1.5mL, thêm 200 µl đệm AE. Để trong 1 phút và ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút. Dung dịch thu được có chứa DNA tổng số.
3.5.5.2. Phương pháp PCR
Nhân bản trình tự DNA của đoạn SSU rDNA (Small subunit ribosomal DNA - 18S) của các mẫu myxosporea bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi 18e (5’-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3’)-Kud6R (5’-TCCAGTAGCTACTCATCG- 3’) và Kud6F (5’-TCACTATCGGAATGAACG-3’) - 18g (5´- GGTAGTAGCGACGGGCGGCGTG-3´) (Hillis and Dixon, 1991; Whipps et
al., 2003). Thành phần phản ứng PCR gồm: H2O = 37,5 µl, Buffer = 5 µl, dNTP
= 2 µl, Primer xi và ngược = 2 µl , Template = 1,5 µl, Enzyme = 2 µl. Chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: giai đoạn khởi đầu 95oC biến tính trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu trình nhiệt 95oC/30 giây, 51oC/40 giây, 72oC/1 phút, giai đoạn cuối kéo dài 72oC trong 3 phút.
Chuẩn bị gel: cân thạch agarose hòa vào dung dịch TAE 1x. Đun trong lị vi sóng đến lúc agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến 60oC, đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã được cài sẵn lược. Sau khoảng 30 - 45 phút, khi gel đã đông cứng, tháo bỏ lược ra khỏi gel và đặt bản gel vào trong bể điện di có chứa dung dịch TAE 1X sao cho bản gel ngập trong dung dịch.
Tra mẫu: trộn sản phẩm PCR với loading buffer 6x theo tỷ lệ 4:1 rồi tra vào giếng điện di.
Điện di: điện thế dùng điện di thường từ 100 - 120V. DNA chuyển từ cực âm sang cực dương. Quan sát sự di chuyển màu của loading buffer để lựa chọn thời gian điện di cho phù hợp để tránh cho mẫu DNA bị chạy ra ngoài.
Nhuộm gel: bản gen chạy xong được nhuộm trong ethidium bromide 0,5µg/ml trong 15 phút có lắc nhẹ. Sau đó chúng sẽ được rửa dưới vòi nước chảy. Soi gel trên đèn UV để đánh giá sản phẩm PCR và chụp ảnh bằng máy ảnh Canon 750D.
3.5.5.3. Phương pháp phân tích số liệu
Sản phẩm PCR rõ băng vạch được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc). Dùng chương trình BLAST để so sánh mức độ tương đồng của trình tự thu được với các trình tự trên Genbank. Phân tích mối quan hệ tiến hóa phân tử của các trình tự thu được với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng phần mềm MEGA 6 theo phương pháp Neighbor Joining (Tamura et al., 2013).