Ở Việt Nam, cây ngô đƣợc trồng khá phổ biến từ rất lâu, cách đây khoảng 300 năm. Kết quả điều tra cơ bản bệnh hại cây trồng ở miền Bắc (Viện BVTV 1967-1968) cho thấy có tới 32 loại bệnh trên cây ngô đã đƣợc phát hiện, trong đó có 30 bệnh do nấm gây ra. Bệnh đốm lá nhỏ ngô là bệnh phát sinh gây hại phổ biến ở tất cả các giai đoạn sinh trƣởng của cây, gây bệnh ở thân, bẹ lá, lá, áo bắp. Khi bệnh phát sinh phát triển nặng có thể gây triệu chứng cháy lá, ảnh hƣởng rõ rệt đến năng suất của giống ngô lai, nhập nội đƣợc gieo trồng ở các vùng sinh thái mùa vụ khác nhau. Vì vậy, việc điều tra xác định thành phần của nấm, diễn biến bệnh đốm lá nhỏ hại ngô vùng Gia Lâm, Hà Nội là cần thiết.
Theo Nguyễn Công Thuật (1997), ở miền Bắc (1977 - 1979) đã xác định có 29 loại, bệnh hại ngô, trong đó có 26 bệnh do nấm. Ở Miền Nam (1977 - 1979) đã xác định có 15 loại bệnh, trong đó có 11 bệnh do nấm. Cũng theo tác giả Nguyễn Công Thuật, các bệnh trên ngô thƣờng gặp bao gồm: bệnh đốm lá nhỏ, bệnh đốm lá lớn, bệnh mốc hồng, bệnh ung thƣ, bệnh khô vằn. Những bệnh này gây ảnh hƣởng tới năng suất của ngô nhƣ: Bệnh phấn đen, mốc hồng, khô vằn có thể làm giảm 30 - 40% năng suất, bệnh đốm lá lớn, bệnh đốm lá nhỏ, gỉ sắt có thể làm giảm 10 - 20% năng suất.
Những nghiên cứu của Nguyễn Công Thuật (1997) cho thấy ẩm độ đất và không khí cao là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển mạnh. Trƣờng hợp đất khô hạn nhƣng ẩm độ không khí cao, tác hại của bệnh càng nặng và năng suất giảm nhiều vì cây ngô bị khô héo nhanh.
Theo Vũ Triệu Mân (1996), ở miền Bắc (1977 - 1979) đã xác định có 29 loại, bệnh hại ngô, trong đó có 26 bệnh do nấm. Ở Miền Nam (1977 - 1979) đã xác định có 15 loại bệnh, trong đó có 11 bệnh do nấm. Các bệnh trên ngô thƣờng gặp bao gồm: bệnh đốm lá nhỏ, bệnh đốm lá lớn, bệnh mốc hồng, bệnh ung thƣ, bệnh khô vằn. Những bệnh này gây ảnh hƣởng tới năng suất của ngô nhƣ: Bệnh phấn đen, mốc hồng, khô vằn có thể làm giảm 30-40% năng suất, bệnh đốm lá lớn, bệnh đốm lá nhỏ, gỉ sắt có thể làm giảm 10-20% năng suất.
Ở miền Bắc, bệnh phát triển nhiều trong các tháng 1, 2 và 11, 12; riêng ở vùng núi phía Bắc bệnh phát triển trong các tháng 4, 5, 6. Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao. Bệnh đốm lá nhỏ có vết bệnh nhỏ nhƣ mũi kim, hơi vàng sau đó lớn rộng ra thành hình tròn hoặc hình bầu dục nhỏ, kích thƣớc vết bệnh khoảng 5- 6 X 1,5 mm, màu vàng nâu hoặc ở giữa hơi xám, có viền nâu đỏ, nhiều khi vết bệnh có quầng vàng (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 2001).
Bipolaris maydis có cành bào tử phân sinh thẳng hoặc hơi cong, màu vàng nâu nhạt, có nhiều ngăng ngang, kích thƣớc 162 - 487 x 5,1 - 8,9 µm. Bào tử phân sinh hình con thoi hơi cong, đa bào, có 2 - 15 ngăn ngang, thƣờng là 5 - 8 ngăn, màu vàng nâu nhạt, kích thƣớc 30 - 150 x 10 - 17 µm. Bào tử phân sinh hình thành thích nhất ở nhiệt độ 20 - 30oC, nảy mầm trong phạm vi nhiệt độ tƣơng đối rộng, thích hợp nhất ở 26 - 32oC; nhiệt độ quá thấp (< 4 oC) hoặc quá cao (>42oC) bào tử không nảy mầm. Sợi nấm sinh trƣởng thích hợp 28 - 30 oC, nhiệt độ tối thiểu 10 - 12 oC, tối đa là 35oC, bào tử phân sinh có sức chịu đựng khá với điều kiện khô, nhất là khi bám trên hạt giống có thể bảo tồn đƣợc hàng năm (Vũ Triệu Mân, 2007).
Bệnh đốm lá nhỏ thƣờng gây hại nhiều ở những ruộng ngô xấu tức là những ruộng không có sự đầu tƣ thâm canh làm cho cây c i cọc, xấu. Ngoài ra những ruộng đất xấu, đất trũng hay bị úng nƣớc, ruộng có kết cấu thịt nặng, chặt, hoặc những ruộng thƣờng xuyên bị thiếu nƣớc...làm cho cây ngô sinh trƣởng kém, c i cọc, không phát triển đƣợc.
Biện pháp ph ng trừ Ph ng trừ bệnh đốm lá nhỏ trƣớc hết phải chú trọng đến các biện pháp thâm canh, tăng cƣờng sinh trƣởng phát triển của cây ngô, nhờ đó đảm bảo cho cây ít bị bệnh và hạn chế tác hại của bệnh. Vì vậy, phải coi trọng việc chọn đất thích hợp để trồng ngô, không để mƣa úng, trũng khó thoát nƣớc, cày bừa kỹ, vùi tàn dƣ lá bệnh c n sót lại xuống lớp đất sâu để diệt nguồn bệnh ở lá cũ, thực hiện gieo ngô đúng thời vụ để cây mọc đều và nhanh, cây phát triển tốt (Vũ Triệu Mân, 2007). Bón đầy đủ N, P, K, bón cân đối, đúng giai đoạn sinh trƣởng, phát tiển của cây ngô, đồng thời chú ý tƣới nƣớc trong thời kì khô hạn nhất là giai đoạn đầu của cây ngô (Vũ Triệu Mân, 2007). Trong thời gian sinh trƣởng có thể tiến hành phun thuốc: dung dịch Tiltsuper 300EC; BenZeb 70 WP; Daconil 75WP, phun vào thời kì cây nhỏ 4 - 6 lá, 7 - 8 lá và trƣớc trỗ cờ, đồng thời kết hợp với bón thúc NPK (Vũ Triệu Mân, 2007). Hạt ngô trƣớc khi gieo
trồng cần đƣợc xử lý bằng thuốc trừ nấm TMTD 3kg/tấn hạt, bắp hạt sau khi thu hoạch cần phơi sấy khô, nhất là các bắp tẻ làm giống cho năm sau (Vũ Triệu Mân, 2007).
Theo Viện Di truyền nông nghiệp (2012), bệnh đốm lá nhỏ là bệnh khá phổ biến trên tất cả các khu vực trồng ngô trong đó có Việt Nam.
Vụ 1: Bệnh phát sinh gây hại khá nặng trên tất cả các giống ngô khảo nghiệm. Tỷ lệ cây ngô bị bệnh đốm lá nhỏ đã quan sát đƣợc trên các giống biến động từ 76,7% ở giống 30B80, 30Y87 đến 88,3% ở giống 30Y87H. Mức độ bị bệnh quan sát đƣợc phổ biến ở cấp bệnh 1 và cấp bệnh 3. Tỷ lệ cây ngô bị nhiễm ở cấp bệnh 1 biến động trong khoảng 20,0 - 48,33%; cây ngô b ị nhiễm ở cấp bệnh 3 là chủ yếu và với tỷ lệ biến động trong khoảng 28,33 - 66,67%; cây ngô bị nhiễm cấp bệnh cao nhất là cấp bệnh 7 với tỷ lệ rất thấp và chỉ là 1,67% . Chỉ số bệnh trung bình của bệnh đốm lá nhỏ trên các gi ống ngô thí nghiệm đạt không thấp, biến động từ 14,81% ở giống 30B80 đến 25, 37% ở giống 30Y87.
Vụ 2: Tỷ lệ bệnh đốm lá nhỏ dao động từ 93,34% - 98,3%, chỉ số bệnh dao động từ 23,33% - 40,67% trên cả giống nền và giống chuyển gen. Trong 3 giống thí nghiệm chỉ có giống 30B80 có chỉ số bệnh là thấp nhất (23,33%) và sai khác có ý nghĩa với giống không chuyển gen 30Y80, nhƣng không sai khác so với giống chuyển gen 30Y87H còn lại. Chỉ số này giữa giống nền (30Y87) và giống chuyển gen (30Y87H) sai khác nhau là không nhiều (47,67%và 40,67%) và không có ý nghĩa. Nhƣ vậy, giữa các giống ngô chuyển gen và không chuyển gen không có sự khác biệt về mức độ bị bệnh đốm lá nhỏ.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Nấm Bipolaris maydis gây bệnh đốm lá nhỏ gây hại trên cây ngô vùng Lƣơng Tài vụ xuân hè năm 2017.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Các giống ngô 3.2.1. Các giống ngô
- Các giống ngô: HN88, LVN4, LVN99... dùng để điều tra theo dõi ngoài đồng ruộng, tiến hành thử nghiệm lây bệnh nhân tạo trong nhà lƣới.
3.2.2. Các hoá chất và các nguyên vật liệu khác dùng trong thí nghiệm
- Các dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm: Một số hóa chất và vật tƣ thiết yếu phục vụ cho nghiên cứu trong phòng và nhà lƣới nhƣ: Agar, đƣờng glucose, đĩa Petri, dao cắt mẫu, panh, đèn cồn, ống đong, giấy lọc, lam kính, lamen, que cấy, chậu, vại, tủ sấy, nồi hấp, tủ lạnh, tủ định ôn, buồng cấy nấm, kính hiển vi, dao, kéo, túi đựng mẫu,…
- Nguồn vi sinh vật đối kháng: nấm Trichoderma viride (T. viride) và vi khuẩn
Bacillus subtilis (B. subtilis) do Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học cung cấp.
Bảng 3.1. Danh lục các isolate nấm T. viride sử dụng trong thí nghiệm
TT Isolate nấm T. viride Kí hiệu
1 Nấm T. viride G - Bộ môn Bệnh cây TV-G 2 Nấm T. viride 1 - Bộ môn Bệnh cây TV-1 3 Nấm T. viride 2 - Bộ môn Bệnh cây TV-2
Bảng 3.2. Danh lục các isolate vi khuẩn đối kháng B. subtilis sử dụng trong thí nghiệm
STT Isolate vi khuẩn Bacillus subtilis (B. subtilis) Kí hiệu
1 Vi khuẩn B. subtilis – Bộ môn Bệnh cây BS - G
2 Vi khuẩn B. subtilis phân lâp từ đất trồng ớt– Bộ môn Bệnh cây BS - O
3 Vi khuẩn B. subtilis phân lâp từ đất trồng cà chua– Bộ môn Bệnh cây BS - C
Hình 3.2. Các isol te vi khuẩn B. subtilis sử dụng trong thí nghiệm 3.2.3. Đất thí nghiệm
Đất đƣợc khử trùng trƣớc khi đem trồng ngô trong nhà lƣới.
3.3. CÁC MÔI TRƢỜNG NHÂN TẠO ĐỂ NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP
NẤM B. MAYDIS
3.3.1. Môi trƣờng PCGA (Pot to C rrot Glucose Agar) 3.3.2. Môi trƣờng PCA (Kho i tây - carot – aga)
3.3.3. Môi trƣờng PGA (Kho i tây – glucose – aga) 3.4. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.4.1. Đị điểm
- Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh cây - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. - Nhà lƣới số 3, nhà lƣới số 7, Khoa Nông học Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4.2. Thời gi n nghiên cứu: Tháng 01 năm 2017 đến tháng 5 năm 2018 3.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.5.1. Điều tr xác định thành phần, mức độ phổ biến bệnh nấm hại cây ngô và diễn biến bệnh đốm lá nhỏ hại ngô vụ xuân hè năm 2017 tại Lƣơng Tài, Bắc Ninh
3.5.2. Điều tr ảnh hƣởng củ các yếu tố sinh thái kỹ thuật đến tình hình phát sinh phát triển củ bệnh đốm lá nhỏ hại ngô năm 2017 tại huyện Lƣơng Tài, Bắc Ninh
3.5.3. Phân ly nuôi cấy, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học củ nấm
Bipolaris maydis hại ngô
3.5.4. Khảo sát hiệu lực ức chế củ nấm Trichoderma viride và vi khuẩn
Bacillus subtilis đối kháng với nấm Bipolaris maydis trên môi trƣờng nhân tạo 3.5.5. Khảo sát tính gây bệnh củ các mẫu phân lập nấm Bipolaris maydis trên một số giống ngô trong điều kiện chậu vại
3.6. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6.1. Phƣơng pháp điều tr ngoài đồng ruộng
- Điều tra theo Phƣơng pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, Viện Bảo vệ thực vật năm 1997: Phƣơng pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Phƣơng pháp điều tra
cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
Điều tra định kỳ: 7 ngày/lần, trong khu vực điều tra cố định ngay từ đầu vụ. Mỗi yếu tố điều tra 5 điểm ngẫu nhiên hoặc phân bố ngẫu nhiên trên đƣờng chéo của khu vực điều tra. Mỗi điểm chọn 5 cây, điều tra toàn bộ số lá trên 5 cây. Điểm điều tra phải cách bờ ít nhất 2 mét.
* Đối với nhóm bệnh hại lá (bệnh đốm lá nhỏ): Phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp: Cấp 1: < 1 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 3: từ 1 – 5 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 5: > 5 – 25 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 7: > 25 – 50 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị bệnh.
của bệnh:
Mức độ phổ biến của bệnh:
+ : Bệnh ít phổ biến (TLB < 5%). ++ : Bệnh khá phổ biến (TLB 5 - 10%). +++ : Bệnh phổ biến (TLB > 10%).
- Ruộng điều tra: Chọn cố định ngay từ đầu vụ, ruộng điều tra phải đại diện cho yếu tố điều tra, mỗi yếu tố điều tra lấy 1 ruộng đại diện. Điều tra ảnh hƣởng của giống (HN88, NVL4, LVN99), đất đai (vùng bãi Minh Tân; Lai Hạ; Trung Kênh) và chế độ luân canh cây trồng (Lúa - Ngô- Ngô; Lúa –Cải bắp - Ngô; Lúa – Lúa - Ngô), sử dụng phân bón (đạm Ure liều lƣợng 6kg/sào; 10kg/sào; 14kg/sào), mật độ (4500 cây/sào, 3600 cây/sào, 3000 cây/sào), trồng xen, thời vụ đến bệnh đốm lá nhỏ ngô.
Các chỉ tiêu cần theo dõi:
Tổng lá bị bệnh - Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng lá điều tra - Chỉ số bệnh (%) = Nxn Nnxn x N x N x N1 1) ( 3 3) ( 5 5) ..( ) ( x 100 Trong đó: N1 là số lá bị bệnh ở cấp 1. N3 là số lá bị bệnh ở cấp 3. Nn là số lá bị bệnh ở cấp n. N là tổng số lá điều tra. n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9). *Phương pháp chẩn đoán bệnh:
Theo “Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam”
Chuẩn đoán bệnh ngoài đồng ruộng: Dựa vào triệu chứng biểu hiện bệnh bên ngoài điển hình.
Chẩn đoán bệnh trong phòng: Tiến hành thu thập mẫu bệnh, phân ly nuôi cấy nấm trong phòng thí nghiệm - Kiểm tra bằng kính hiển vi - Phân loại theo
các tài liệu giám định bệnh.
* Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh:
Chọn ruộng ngô trong vùng điều tra có cây bị bệnh đốm lá, thu thập những cây có triệu chứng bệnh điển hình của bệnh đốm lá nhỏ. Tất cả các mẫu thu thập đều ghi rõ tên cây trồng, ngày điều tra và địa điểm thu thập mẫu.
3.6.2. Phƣơng pháp điều chế môi trƣờng nhân tạo để nuôi cấy nấm.
Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh: Dụng cụ thuỷ tinh rửa sạch bằng xà phòng, rửa lại bằng cồn 70%, phơi khô trên giá, đóng gói bằng giấy bạc bọc thực phẩm, đặt vào tủ sấy ở 160o
C trong 3 giờ.
3.6.2.1. Môi trường Potato glucose agar (PGA)
Thành phần: Khoai tây: 200g, Agar : 20g, Đƣờng glucose: 20g, Nƣớc cất: 1 lít.
Điều chế môi trƣờng : Khoai tây rửa sạch thái lát mỏng cho vào nồi cùng 1000ml nƣớc đun sôi trong khoảng 45phút, lọc qua vải lọc, bổ sung nƣớc cất cho đủ 1000ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều đun đến khi sôi. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC (1,5 atm) trong vòng 45 phút. Để nguội trong 50 - 60oC trƣớc khi rót.
3.6.2.2. Môi trường PCGA (Potato Carrot Glucose Agar)
Thành phần : Khoai tây: 100g; Cà rốt: 100g; Glucose: 20g; Agar: 20g; Nƣớc cất: 1000ml.
Điều chế môi trƣờng : Khoai tây, cà rốt rửa sạch thái lát mỏng cho vào nồi cùng 1000ml nƣớc đun sôi trong khoảng 45 phút, lọc qua vải lọc, bổ sung nƣớc cất cho đủ 1000ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều đun đến khi sôi. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC (1,5 atm) trong v ng 45 phút. Để nguội trong 50 - 60oC trƣớc khi rót.
3.6.2.3. Môi trường Potato carrot agar ( PCA )
Thành phần: Khoai tây: 100g, Cà rốt : 100g, Agar : 20g, Nƣớc cất : 1 lít. Khoai tây, cà rốt gọt vỏ sạch, thái lát mỏng đem đun sôi với nƣớc cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nƣớc cất đủ 1 lít đun sôi và cho agar khuấy cho tan hết, sau đó đổ ra bình tam giác và khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 1.5 atm (121°C) trong 30 phút.
3.6.2.4. Môi trường (CGA )
Thành phần: Cà rốt: 100g, Glucose: 20g, Agar : 20g, Nƣớc cất : 1 lít.
Cà rốt gọt vỏ sạch, thái lát mỏng đem đun sôi với nƣớc cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nƣớc cất đủ 1 lít đun sôi và cho agar, đƣờng glucose vào khuấy cho tan hết, sau đó đổ ra bình tam giác và khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 1.5 atm (121°C) trong 30 phút.
3.6.3. Phƣơng pháp phân lập nấm
Phân lập nấm hại cây ngô dựa theo Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam năm 2009 (Lester W.Burgess et al., 2009).
Lau sạch bàn làm việc bằng cồn 70%. Khử trùng dụng cụ bằng cồn 70%. Rửa mẫu lá trong nƣớc để loại bỏ đất bụi và tạp chất. Khử trùng mẫu bằng cồn 70%. Cắt những miếng cấy nhỏ (khoảng 2 x 2 mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, cấy lên đĩa môi trƣờng. Mỗi đĩa petri đặt 7 - 9 vết mô bệnh. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 28oC. Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm đã phát triển thì tiến hành cấy truyền chúng để nhận đƣợc nguồn nấm thuần.
3.6.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng củ môi trƣờng đến sự phát triển củ nấm
B. maydis
* Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 đĩa petri: