Phƣơng pháp nghiên cứu

3.6.1. Phƣơng pháp điều tr ngoài đồng ruộng

- Điều tra theo Phƣơng pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, Viện Bảo vệ thực vật năm 1997: Phƣơng pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Phƣơng pháp điều tra

cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

Điều tra định kỳ: 7 ngày/lần, trong khu vực điều tra cố định ngay từ đầu vụ. Mỗi yếu tố điều tra 5 điểm ngẫu nhiên hoặc phân bố ngẫu nhiên trên đƣờng chéo của khu vực điều tra. Mỗi điểm chọn 5 cây, điều tra toàn bộ số lá trên 5 cây. Điểm điều tra phải cách bờ ít nhất 2 mét.

* Đối với nhóm bệnh hại lá (bệnh đốm lá nhỏ): Phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp: Cấp 1: < 1 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 3: từ 1 – 5 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 5: > 5 – 25 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 7: > 25 – 50 % diện tích lá bị bệnh. Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị bệnh.

của bệnh:

Mức độ phổ biến của bệnh:

+ : Bệnh ít phổ biến (TLB < 5%). ++ : Bệnh khá phổ biến (TLB 5 - 10%). +++ : Bệnh phổ biến (TLB > 10%).

- Ruộng điều tra: Chọn cố định ngay từ đầu vụ, ruộng điều tra phải đại diện cho yếu tố điều tra, mỗi yếu tố điều tra lấy 1 ruộng đại diện. Điều tra ảnh hƣởng của giống (HN88, NVL4, LVN99), đất đai (vùng bãi Minh Tân; Lai Hạ; Trung Kênh) và chế độ luân canh cây trồng (Lúa - Ngô- Ngô; Lúa –Cải bắp - Ngô; Lúa – Lúa - Ngô), sử dụng phân bón (đạm Ure liều lƣợng 6kg/sào; 10kg/sào; 14kg/sào), mật độ (4500 cây/sào, 3600 cây/sào, 3000 cây/sào), trồng xen, thời vụ đến bệnh đốm lá nhỏ ngô.

Các chỉ tiêu cần theo dõi:

Tổng lá bị bệnh - Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng lá điều tra - Chỉ số bệnh (%) =   Nxn Nnxn x N x N x N1 1) ( 3 3) ( 5 5) ..( ) (    x 100 Trong đó: N1 là số lá bị bệnh ở cấp 1. N3 là số lá bị bệnh ở cấp 3. Nn là số lá bị bệnh ở cấp n. N là tổng số lá điều tra. n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9). *Phương pháp chẩn đoán bệnh:

Theo “Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam”

Chuẩn đoán bệnh ngoài đồng ruộng: Dựa vào triệu chứng biểu hiện bệnh bên ngoài điển hình.

Chẩn đoán bệnh trong phòng: Tiến hành thu thập mẫu bệnh, phân ly nuôi cấy nấm trong phòng thí nghiệm - Kiểm tra bằng kính hiển vi - Phân loại theo

các tài liệu giám định bệnh.

* Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh:

Chọn ruộng ngô trong vùng điều tra có cây bị bệnh đốm lá, thu thập những cây có triệu chứng bệnh điển hình của bệnh đốm lá nhỏ. Tất cả các mẫu thu thập đều ghi rõ tên cây trồng, ngày điều tra và địa điểm thu thập mẫu.

3.6.2. Phƣơng pháp điều chế môi trƣờng nhân tạo để nuôi cấy nấm.

Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh: Dụng cụ thuỷ tinh rửa sạch bằng xà phòng, rửa lại bằng cồn 70%, phơi khô trên giá, đóng gói bằng giấy bạc bọc thực phẩm, đặt vào tủ sấy ở 160o

C trong 3 giờ.

3.6.2.1. Môi trường Potato glucose agar (PGA)

Thành phần: Khoai tây: 200g, Agar : 20g, Đƣờng glucose: 20g, Nƣớc cất: 1 lít.

Điều chế môi trƣờng : Khoai tây rửa sạch thái lát mỏng cho vào nồi cùng 1000ml nƣớc đun sôi trong khoảng 45phút, lọc qua vải lọc, bổ sung nƣớc cất cho đủ 1000ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều đun đến khi sôi. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC (1,5 atm) trong vòng 45 phút. Để nguội trong 50 - 60oC trƣớc khi rót.

3.6.2.2. Môi trường PCGA (Potato Carrot Glucose Agar)

Thành phần : Khoai tây: 100g; Cà rốt: 100g; Glucose: 20g; Agar: 20g; Nƣớc cất: 1000ml.

Điều chế môi trƣờng : Khoai tây, cà rốt rửa sạch thái lát mỏng cho vào nồi cùng 1000ml nƣớc đun sôi trong khoảng 45 phút, lọc qua vải lọc, bổ sung nƣớc cất cho đủ 1000ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều đun đến khi sôi. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC (1,5 atm) trong v ng 45 phút. Để nguội trong 50 - 60oC trƣớc khi rót.

3.6.2.3. Môi trường Potato carrot agar ( PCA )

Thành phần: Khoai tây: 100g, Cà rốt : 100g, Agar : 20g, Nƣớc cất : 1 lít. Khoai tây, cà rốt gọt vỏ sạch, thái lát mỏng đem đun sôi với nƣớc cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nƣớc cất đủ 1 lít đun sôi và cho agar khuấy cho tan hết, sau đó đổ ra bình tam giác và khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 1.5 atm (121°C) trong 30 phút.

3.6.2.4. Môi trường (CGA )

Thành phần: Cà rốt: 100g, Glucose: 20g, Agar : 20g, Nƣớc cất : 1 lít.

Cà rốt gọt vỏ sạch, thái lát mỏng đem đun sôi với nƣớc cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nƣớc cất đủ 1 lít đun sôi và cho agar, đƣờng glucose vào khuấy cho tan hết, sau đó đổ ra bình tam giác và khử trùng bằng nồi hấp ở áp suất 1.5 atm (121°C) trong 30 phút.

3.6.3. Phƣơng pháp phân lập nấm

Phân lập nấm hại cây ngô dựa theo Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam năm 2009 (Lester W.Burgess et al., 2009).

Lau sạch bàn làm việc bằng cồn 70%. Khử trùng dụng cụ bằng cồn 70%. Rửa mẫu lá trong nƣớc để loại bỏ đất bụi và tạp chất. Khử trùng mẫu bằng cồn 70%. Cắt những miếng cấy nhỏ (khoảng 2 x 2 mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh, cấy lên đĩa môi trƣờng. Mỗi đĩa petri đặt 7 - 9 vết mô bệnh. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 28oC. Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm đã phát triển thì tiến hành cấy truyền chúng để nhận đƣợc nguồn nấm thuần.

3.6.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng củ môi trƣờng đến sự phát triển củ nấm

B. maydis

* Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 đĩa petri:

+ Công thức 1: Nuôi cấy nấm B. maydis trên môi trƣờng PGA + Công thức 2: Nuôi cấy nấm B. maydis trên môi trƣờng PCGA + Công thức 3: Nuôi cấy nấm B. maydis trên môi trƣờng CGA

* Chỉ tiêu theo dõi: Đƣờng kính tản nấm (mm) sau 1, 2, 3, 4, 5 ngày để đánh giá sự phát triển của nấm trên các môi trƣờng nuôi cấy nhân tạo.

3.6.5. Đánh giá tính gây bệnh củ loài nấm B. maydis

- Chuẩn bị nguồn nấm lây nhiễm bệnh: các isolate nấm B. maydis.

- Chuẩn bị cây ký chủ lây bệnh: các giống ngô HN88, LVN4, LVN99. - Giai đoạn sinh trƣởng: cây ngô ở giai đoạn 3-7 lá thật (khoảng 30 - 45 ngày sau gieo trồng).

- Vị trí lây nhiễm: Đối với nấm B. maydis lây nhiễm trên phiến lá. - Phƣơng pháp lây bệnh:

+ Dùng que đột nấm có kích thƣớc 3mm đột nấm Bipolaris maydis trên đĩa petri.

+Dùngkim mũi mác đặt miếng thạch đã đột sẵn có chứa sợi nấm lên vị trí cần lây bệnh và dùng băng dính để cố định miếng thạch. Mỗi isolate lây 90 vết trên mỗi giống. Đảm bảo vị trí lây nhiễm luôn đủ ẩm. Mỗi công thức thực hiện 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là 10 vết lây nhiễm.

- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi thời gian tiềm dục, số lƣợng vết phát bệnh.

Đo kích thƣớc vết bệnh (mm) sau lây nhiễm 3, 5, 7, 9 ngày.

3.6.6. Khảo sát hiệu lực đối kháng củ nấm Trichoderma viride đối với loài nấm B. maydis hại ngô trên môi trƣờng nhân tạo PGA

* Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng PGA, ở nhiệt độ 280C ± 20C, gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri:

+ CT 1 (đối chứng): Cấy riêng rẽ nấm B. maydis.

+ CT 2: Cấy nấm đối kháng T. viride trƣớc, sau 24h cấy nấm B. maydis.

+ CT 3: Cấy đồng thời nấm B. maydis với nấm đối kháng T. viride. + CT 4: Cấy nấm B. maydis trƣớc, sau 24h cấy nấm đối kháng T. viride. * Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính tản nấm (mm) của nấm B. maydis và tính hiệu lực ức chế của nấm T. viride với nấm B. maydis trên môi trƣờng PGA sau 1, 2, 3, 4 ngày cấy.

Hình 3.3. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hiệu lực đối kháng củ nấm T. viride với nấm gây bệnh B. maydis

3.6.7. Khảo sát hiệu lực đối kháng củ vi khuẩn Bacillus subtilis đối với loài nấm B.m ydis hại ngô trên môi trƣờng nhân tạo PGA

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng PGA, ở nhiệt độ 280C ± 20C, gồm 4 công thức mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 hộp petri:

 Công thức 1(đối chứng): Cấy nấm B. maydis riêng rẽ trên môi trƣờng PGA.

 Công thức 2: Cấy vi khuẩn B. subtilis trƣớc, sau 24h cấy nấm B. maydis.

 Công thức 3: Cấy đồng thời nấm B. maydis với vi khuẩn B. subtilis.

 Công thức 4: Cấy nấm B. maydis trƣớc, sau 24h cấy vi khuẩn B. subtilis. * Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính tản nấm B. maydis (mm) và tính hiệu lực ức chế của vi khuẩn B. subtilis với nấm B. maydis trên môi trƣờng nhân tạo PGA sau 1, 2, 3, 4, 5 ngày.

Hình 3.4. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát HLĐK củ vi khuẩn Ba.subtilis

với nấm B. maydis

3.7. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI, ĐÁNH GIÁ

- Tỷ lệ bệnh (%)

A

TLB (%) = x 100 B

Trong đó:

A là tổng số lá (cây) bị bệnh B là tổng số lá (cây) điều tra

- Chỉ số bệnh (%) Σ (a x b) CSB(%) = x 100 N x T Trong đó : a: Số lá bị bệnh ở mỗi cấp b: Số lá bị bệnh ở cấp tƣơng ứng

T: Cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp bệnh N: Tổng số lá điều tra

- Hiệu lực ức chế % (HLƯC) của nấm T. viride (hoặc vi khuẩn B. subtilis) với nấm B. maydis.

C - T HLƢC (%) = x 100 C Trong đó: HLƢC là hiệu lực ức chế (%). C: đƣờng kính tản nấm (mm) ở công thức đối chứng. T: đƣờng kính tản nấm (mm) ở các công thức thí nghiệm.

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. ĐIỀU TRA THÀNH PHẦN BỆNH NẤM CHÍNH HẠI NGÔ TẠI XÃ MINH TÂN, HUYỆN LƢƠNG TÀI, TỈNH BẮC NINH

Trên cây ngô có rất nhiều loài nấm gây hại khác nhau, để khảo sát thành phần, mức độ phổ biến của các bệnh do nấm gây ra trên ngô, chúng tôi tiến hành điều tra thành phần bệnh nấm chính hại ngô vụ xuân hè tại xã Minh Tân, huyện Lƣơng Tài, tỉnh Bắc Ninh trên các giống ngô đƣợc trồng tại đây. Điều tra định kì 7 ngày một lần theo quy chuẩn kĩ thuật quốc gia về phƣơng pháp điều tra, phát hiện dịch hại cây ngô (QCVN 01-167/2014 : BNNPTNT) thu đƣợc kết quả ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Thành phần bệnh chính hại ngô vụ xuân hè tại xã Minh Tân, huyện Lƣơng Tài, tỉnh Bắc Ninh.

STT Tên bệnh Giai đoạn cây bị bệnh Bộ phận bị hại Mức độ gây hại Tên Vệt N m Tên kho học

1 Đốm lá nhỏ Bipolaris maydis 3-4 lá Lá +++

2 Đốm lá lớn Exserohilum turcicum 7-8 lá Lá ++

3 Khô vằn Rhizoctonia solani 8-10 lá Thân,bẹ lá +

4 Gỉ sắt Puccinia maydis 9-10 lá Lá +++

Ghi chú: + Bệnh nhẹ TLB < 5%; ++ Bệnh trung bình TLB 5-10%; +++ Bệnh nặng TLB > 10%

Qua bảng 4.1 chúng tôi thấy: thành phần bệnh chính hại ngô vụ xuân hè tại xã Minh Tân phong phú, giai đoạn bị bệnh, bộ phận bị hại và mức độ gây hại giữa các bệnh là khác nhau. Bệnh xuất hiện từ khi cây đƣợc 3 - 4 lá cho đến khi thu hoạch, chủ yếu bệnh gây hại nhiều trên lá từ giai đoạn cây 5 - 6 lá đến 8 - 10 lá. Bệnh gây hại trên khắp các bộ phận của cây từ lá, bẹ lá, thân, bắp, áo bắp,... Bệnh gây hại nặng điển hình là bệnh đốm lá nhỏ, bệnh xuất hiện sớm nhất khi cây ngô đƣợc 3 - 4 lá và tồn tại trong suốt quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây ngô, bệnh hại chủ yếu ở lá và một phần ở bẹ lá. Tiếp đến bệnh gỉ sắt cũng là một bệnh gây hại nhiều cho cây ngô, bệnh hại chủ yếu ở lá, mặc dù bệnh xuất hiện muộn hơn nhƣng khả năng gây hại của bệnh lớn hơn so với bệnh đốm lá lớn và bệnh đốm lá nhỏ vì nấm gây hại tấn công, xâm nhập và làm chết tế bào lá, làm cho lá bị khô, chết hoại, mất khả năng quang hợp. Bệnh đốm lá lớn xuất hiện sau bệnh đốm lá nhỏ, giai đoạn cây 5 - 6 lá bệnh bắt đầu xuất hiện và gây hại mạnh

cho đến cuối vụ. Bệnh khô vằn xuất hiện vào giai đoạn cây 8 - 10 lá gây hại chủ yếu ở bẹ lá, thân nhiễm với mức độ trung bình trên đồng ruộng.

A B

C D

Hình 4.1. Thành phần bệnh chính hại ngô vụ xuân hè tại xã Minh Tân, huyện Lƣơng Tài, tỉnh Bắc Ninh.

Ghi chú: A: Bệnh đốm lá nhỏ ngô (Bipolaris maydis)

C: Bệnh gỉ sắt ngô (Puccinia maydis)

B: Bệnh đốm lá lớn ngô (Exserohilum turcicum)

D: Bệnh khô vằn ngô (Rhizoctonia solani).

4.2. TÌNH HÌNH PHÁT SINH, PHÁT TRIỂN GÂY HẠI CỦA BỆNH ĐỐM LÁ NHỎ (Bipolaris maydis) TRÊN NGÔ VỤ XUÂN HÈ TẠI HUYỆN LƢƠNG TÀI, TỈNH BẮC NINH

4.2.1. Tình hình phát sinh, phát triển gây hại củ bệnh đốm lá nhỏ ngô ở một số đị phƣơng khác nh u tại huyện Lƣơng Tài

Điều tra diễn biến bệnh đốm lá nhỏ hại ngô nếp HN88 ở các vùng trồng ngô vụ xuân hè tại huyện Lƣơng Tài ta đƣợc bảng 4.2 và đồ thị 4.1.

Bảng 4.2. Diễn biến bệnh đốm lá nhỏ (Bipolaris maydis) hại ngô nếp HN88 ở các vùng trồng ngô vụ xuân hè tại huyện Lƣơng Tài

Ngày

điều tr Gi i đoạn

Minh Tân L i Hạ Trung Kênh TLB (%) CSB (%) TLB (%) CSB (%) TLB (%) CSB (%) 11/2 Cây con - - - - 18/2 3-4 lá 5,68 0,63 5,2 0,44 3,33 0,37 25/2 5-6 lá 12,32 1,45 8,03 1,22 6,9 1,07 3/3 7-8 lá 19,15 3,19 16,93 2,47 14,58 2,26 10/3 Xoáy nõn 23,33 4,07 21,36 3,8 20,34 3,69 17/3 Trỗ cờ, phun râu 22,57 3,4 18,84 3,19 16,29 2,63 24/3 Tung phấn, thụ tinh 20,29 2,83 16,28 2,52 14,29 2,22 31/3 Chín sữa 17,77 2,71 14,49 2,32 12,64 2,09 7/4 Chín sáp 15,76 2,45 12,75 2,13 11,24 1,81

Đồ thị 4.1. Diễn biến bệnh đốm lá nhỏ hại ngô nếp HN88 ở các vùng trồng ngô vụ xuân hè tại huyện Lƣơng Tài

Qua bảng 4.2 cho thấy: Ở các vùng khác nhau thì diễn biến bệnh đốm lá nhỏ ngô (Bipolaris maydis) trên giống ngô HN88 là khác nhau. Bệnh phát sinh và gây hại tăng dần từ giai đoạn 3 - 4 lá đến xoáy nõn, sau đó bệnh giảm dần. Bệnh hại nặng nhất ở giai đoạn 7 - 8 lá đến xoáy nõn. Bệnh đốm lá nhỏ (Bipolaris maydis) gây hại trên giống ngô HN88 cao nhất ở vùng đất xã Minh Tân với TLB 23,33%,

CSB 4,07%; ở vùng Lai Hạ, vùng đất Trung Kênh bệnh đốm lá nhỏ ngô (Bipolaris maydis) gây hại trên giống ngô HN88 là thấp hơn.

Do đó ở các vùng khác nhau bệnh đốm lá nhỏ ngô (Bipolaris maydis) gây hại khác nhau nguyên nhân là do chế độ chăm sóc, nguồn bệnh từ vụ trƣớc để lại, bệnh đi theo hạt giống,...

4.2.2. Tình hình phát sinh, phát triển gây hại củ bệnh đốm lá nhỏ ngô trên một số nền luân c nh khác nh u tại huyện Lƣơng Tài.

Điều tra diễn biến bệnh đốm lá nhỏ hại ngô nếp HN88 vụ xuân hè ở các chế độ luân canh khác nhau đƣợc trồng tại xã Minh Tân thể hiện ở bảng 4.3 và đồ thị 4.2.

Bảng 4.3. Diễn biến bệnh đốm lá nhỏ (Bipolaris maydis) hại ngô nếp HN88 ở các chế độ luân canh khác nhau vụ xuân hè 2017 tại xã Minh Tân

Ngày điều tra Gi i đoạn Lúa – Ngô – Ngô Lúa- Cải bắp –

Ngô Lúa- Lúa -Lgô TLB (%) CSB (%) TLB (%) CSB (%) TLB (%) CSB (%) 11/2 Cây con - - - - 18/2 3-4 lá 5,68 0,63 5,26 0,58 4,44 0,49 25/2 5-6 lá 13,04 2,75 9,49 1,38 8,97 1,23 3/3 7-8 lá 19,68 3,19 18,52 2,64 17,19 2,49 10/3 Xoáy nõn 24,29 3,97 22,22 3,64 19,17 2,56 17/3 Trỗ cờ, phun râu 21,58 3,16 20,26 3 14,86 2,31 24/3 Tung phấn, thụ tinh 18,68 2,6 16,1 2,42 13,51 2,1 31/3 Chín sữa 16,27 2,46 14,47 2,25 11,43 1,97 7/4 Chín sáp 15,7 2,37 13,16 2,11 10,29 1,68

Qua số liệu điều tra ở bảng 4.3 và đồ thị 4.2 chúng tôi nhận thấy: bệnh đốm