3.1.1. Địa điểm thu mẫu
Tại 3 xã Hòa Tiến, Tam Giang và Thụy Hòa thuộc huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh. Đây là 3 xã đại diện cho 3 địa phương có số lượng đàn gà và số trang trại, gia trại, hộ chăn nuôi gà lớn nhất trên địa bàn huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh.
3.1.2. Phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm
Phòng thí nghiệm bộ môn Ký sinh trùng, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh Lý, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Phòng Thí nghiệm Trung tâm Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2016 đến tháng 8/2017.
3.3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU3.3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.3.1.1. Gà nuôi theo hướng công nghiệp trong trong chuồng hở tại các trang trại, gia trại
3.3.1.2. Các đơn bào ký sinh - Leucocytozoon spp.
- Haemoproteus spp.
- Plasmodium spp. - Trypanosoma spp.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Dụng cụ, phương tiện kiểm tra ký sinh trùng máu: Kính hiển vi, kính lúp. Bộ đồ giải phẫu gồm có dao, kéo, phanh, lam kính, lamen, đĩa lồng, hộp đựng tiêu bản,…
- Hóa chất: Cồn, thuốc nhuộm Giemsa, hóa chất chạy chỉ tiểu huyết học máu gà, thuốc thú y.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Xác định loài ký sinh trùng ký sinh trong máu gà bệnh
3.4.2. Tình hình mắc ký sinh trùng đường máu do Leucocytozoon spp. trên đàn gà nuôi theo hướng công nghiệp trong chuồng hở tại huyện Yên Phong, đàn gà nuôi theo hướng công nghiệp trong chuồng hở tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh
- Xác định tỷ lệ gà mắc ký sinh trùng đường máu do Leucocytozoon spp. theo từng xã khác nhau.
- Xác định tỷ lệ gà mắc ký sinh trùng đường máu do Leucocytozoon spp theo lứa tuổi gà.
- Xác định tỷ lệ gà mắc ký sinh trùng đường máu do Leucocytozoon spp theo giống gà.
- Xác định tỷ lệ và cường độ mắc ký sinh trùng đường máu do
Leucocytozoon spp. theo mùa vụ.
3.4.3. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý bệnh ký sinh trùng đường máu do Leucocytozoon gây ra ở gà Leucocytozoon gây ra ở gà
- Xác định các biểu hiện lâm sàng của gà bị bệnh. - Xác định biến đổi bệnh lý đại thể của gà bị bệnh - Biến đổi vi thể ở một số khí quan của gà bệnh.
- Xác định một số chỉ tiêu huyết học của gà bệnh so với gà khỏe.
3.4.4. Nghiên cứu lựa chọn phác đồ điều trị bệnh có hiệu quả cao
- Thử nghiệm một số thuốc kháng sinh, phác đồ điều trị bệnh trên gà do
Leucocytozoon spp. gây ra.
- Lựa chọn loại thuốc, phác đồ điều trị an toàn và có hiệu quả cao để ứng dụng điều trị cho gà trên thực địa.
- Nghiên cứu loại thuốc điều trị bệnh.
3.4.5. Đề xuất biện pháp phòng, trị bệnh do Leucocytozoon spp. gây ra cho gà ở huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh gà ở huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp lấy mẫu 3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
- Nghiên cứu đánh giá tình trạng nhiễm ký sinh trùng đường máu theo nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
- Chọn mẫu nghiên cứu
Chọn mẫu theo phương pháp phân tầng: Chọn 3 xã. Mỗi xã chọn 2 trại 1 trại gà nuôi thịt, 1 trại nuôi gà đẻ với giống gà khác nhau theo kiểu chuồng hở để nghiên cứu.
- Cỡ mẫu nghiên cứu xác định theo công thức dịch tễ học N= (1,96)2 × p(1 – p)/ d2
Trong đó:
N là cỡ mẫu, p là tỷ lệ ước đoán, 1,96 là độ chính xác mong muốn 95%, d là sai số ước lượng.
- Tỷ lệ ước đoán trong nghiên cứu dựa trên kết quả nghiên cứu ở tỉnh Thái Nguyên của Nguyễn Văn Sửu, (2012), lựa chọn theo tỷ lệ nhiễm chung của gà là 30,37%. Sai số ước lượng là 0.05.
- Cỡ mẫu cần lấy là 322 gà và được làm tròn là 320 gà trên 1 trại.
- Số lượng gà trong mẫu được lấy theo 3 độ tuổi: dưới (<) 7 ; 7 đến (=) 18 và trên (>) 18 tuần tuổi. Phân chia các nhóm tuổi dựa trên các cơ sở: gà <7 tuần nuôi theo điều kiện nuôi úm, gà 7 - 18 tuần nuôi theo điều kiện nuôi thịt, gà > 18 tuần là gà hậu bị và gà đẻ.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng theo nghiên cứu mô tả ca bệnh
(Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Chọn gà bệnh đã được phát hiện từ các trại nghiên cứu để nghiên cứu triệu chứng lâm sàng.
Thí nghiệm 1: Xác định thành phần giống ký sinh trùng đường máu.
+ Trong huyện chọn 3 xã, mỗi xã chọn 3 trại gà nuôi theo hình thức chuồng nuôi hở.
Mỗi trại lấy máu của 320 gà thuộc 3 độ tuổi: dưới (<) 7 tuần tuổi; 7 đến (=) 18 tuần tuổi và trên (>) 18 tuần tuổi.
Số lượng gà kiểm tra được phân bổ đồng đều cho từng tháng trong năm. Lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà và làm tiêu bản máu dàn, tiêu bản máu
được nhuộm bằng thuốc giemsa và kiểm tra phát hiện Ký sinh trùng đường máu tại phòng thí nghiệm bộ môn Ký sinh trùng, khoa Thú y, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Giống ký sinh trùng ký sinh trong máu gà, tỷ lệ nhiễm Ký sinh trùng của gà tại các địa điểm nghiên cứu, tuổi gà nhiễm ký sinh trùng, mùa vụ gà mắc bệnh.
Thí nghiệm 2: Theo dõi triệu chứng lâm sàng của gà mắc bệnh ký sinh trùng đường máu
Tại mỗi trại gà nghiên cứu, chọn 10 gà đã phát bệnh đã được chẩn đoán mắc bệnh ký sinh trùng đường máu. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng qua quan sát các dấu hiệu xuất hiện trên gà bệnh, mô tả và chụp ảnh.
Các chỉ tiêu theo dõi: trạng thái, lông, da, ăn uống, vận động, trạng thái thần kinh, phân, mào, da.
3.5.2.2. Nghiên cứu bệnh tích đại thể và bệnh tích vi thể theo nghiên cứu mô tả ca bệnh (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)
Chọn gà bệnh đã được chẩn đoán mắc bệnh ký sinh trùng đường máu để nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể
Thí nghiệm 3: Theo dõi bệnh tích của gà mắc bệnh ký sinh trùng đường máu
Tại mỗi trại nghiên cứu chọn 10 gà bệnh đã được chẩn đoán mắc bệnh ký sinh trùng đường máu đang phát bệnh. Nghiên cứu bệnh tích đại thể qua mổ khám gà quan sát các dấu hiệu xuất hiện trên các cơ quan bộ phận của gà, mô tả và chụp ảnh.
Chỉ tiêu theo dõi: Biến đổi của các cơ quan như: Da, cơ, hệ tiêu hóa, bai tiết, hô hấp, tuần hoàn và thần kinh.
Qua mổ khám, thu thập những bộ phận có bệnh tích điển hình bảo quản trong formon 10% và làm tiêu bản vi thể.
Chỉ tiêu theo dõi: Biến đổi ở mức độ tế bào của các bộ phận của gà bị mắc bệnh ký sinh trùng đường máu.
3.5.2.3. Nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý máu của gà mắc bệnh ký sinh trùng
đường máu của và gà khỏe theo nghiên cứu mô tả ca bệnh (Nguyễn Như
Lấy máu gà bệnh đã được xác định mắc bệnh ký sinh trùng đường máu qua tiêu bản máu dàn nhuộm giemsa và máu của gà khỏe để nghiên cứu biến đổi các chỉ tiêu sinh lý máu của gà.
Phân tích chỉ tiêu máu gà bị bệnh
Mỗi trại chọn 10 gà bệnh đã được xác định mắc bệnh ký sinh trùng đường máu qua tiêu bản máu dàn nhuộm giemsa, 10 gà khỏe để nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý máu.
Máu gà được lấy từ tĩnh mạch cánh vào các buổi sáng, giữ trong ống đựng máu tiêu chuẩn đã chứa sẵn chất chống đông được phân tích trên máy phân tích máu.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng hồng cầu, tỷ khối huyết cầu, hàm lượng Haemoglobin, thể tích bình quân của hồng cầu. Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu của gà bị bệnh ký sinh trùng đường máu và không mắc bệnh ký sinh trùng đường máu.
3.5.2.4. Thử nghiệm thuốc điều trị theo nghiên cứu thực nghiệm
Chọn gà đã được chẩn đoán mắc bệnh ký sinh trùng đường máu qua tiêu bản máu dàn nhuộm giemsa, những gà ở giai đoạn phát bệnh, thử nghiệm điều trị với thuốc chống ký sinh trùng đường máu ở gà.
Thí nghiệm 4: Thử nghiệm thuốc điều trị bệnh ký sinh trùng đường máu trên gà bệnh
Thí nghiệm được tiến hành trên 3 trại gà có nhiều gà mắc bệnh ký sinh trùng đường máu đã được chẩn đoán qua kiểm tra máu. Dự kiến số lượng gà bệnh được thử nghiệm điều trị là 540 (mỗi trại 180 con) gà được thu thập và phân làm 3 lô, mỗi lô 60 gà tương ứng với 3 loại thuốc đang có trên thị trường là Methocin, Nanococcis do công ty Nanovet cung cấp và Daimenton do công ty thuốc thú y toàn cầu cung cấp.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hiệu lực của thuốc trong điều trị, phản ứng phụ của thuốc và thời gian tái phát bệnh sau điều trị.
4.5.2.5. Kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu
- Xét nghiệm ký sinh trùng bằng kỹ thuật phiết kính máu gà và nhuộm bằng thuốc nhuộm giemsa (Trịnh Văn Thịnh, 1963).
Schmidt and Larry S. Roberts (2009), Trịnh văn Thịnh (1963).
Các giống ký sinh trùng được phát hiện qua tiêu bản máu nhuộm giemsa soi dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần. Phân loại ký sinh trùng tới giống dựa vào các đặc điểm hình thái của ký sinh trùng trong hồng cầu và bạch cầu và hình thái của hồng cầu, bạch cầu bị nhiễm ký sinh trùng qua các tiêu chí phân biệt sau:
Giống đơn bào Đặc trưng xuất hiện trên tiêu bản máu nhuộm
Haemoproteus 1. Gametocytes chỉ hiện diện trong hồng cầu
- Gametocytes có xuất hiện “hình dây” với dịch chuyển nhỏ của
hạt nhân chủ
- Thể phân liệt không nhìn thấy trên phết tế bào máu - Nhiều sắc tố màu nâu (hemozoin) có mặt trong hồng cầu
Plasmodium 1. Merozoites, phân liệt hoặc Gametocytes có thể được nhìn thấy
trong hồng cầu, có thể làm dịch chuyển nhân hồng cầu
- Merozoites có một vòng nhẫn
- Phân liệt là vòng bao gồm hình bầu dục có chứa Merozoites
- Gametocytes có xuất hiện một dây hình tương tự như
Hemoproteus nhưng hạt sắc tố màu vàng nâu là ít hơn
2. Ký sinh trùng cũng có thể được tìm thấy trong các tế bào khác bao gồm Thrombocytes, bạch cầu và các tế bào nội mô.
Leucocytozoon 1. Gametocytes làm sưng, làm biến dạng hồng cầu và bạch cầu bị
nhiễm.
- Bạch cầu sưng to có hình giống như quả bóng đá - Hồng cầu vót nhọn và kéo dài ở 2 đầu
- Không có hạt sắc tố trong hồng cầu
Trypanosoma 1. Ký sinh trùng ở ngoài hồng cầu
- Trypanosoma có hình thoi, bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất
bắt màu tím.
Hình 3.1. Hồng cầu nhiễm Leucocytozoon Hình 3.2. Hồng cầu nhiễm Haemoproteus Hình 3.3. Hồng cầu nhiễm Plasmodium spp. Hình 3.4. Máu nhiễm Trypanosoma spp.
- Cường độ nhiễm ký sinh trùng được xác định qua số lượng hồng cầu nhiễm bệnh và số lượng hồng, bạch cầu trung bình trong 3 vi trường kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần trên tiêu bản máu. Dựa trên cơ sở khoa học gà phát bệnh khi trong vi trường kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần có 4 đến 6 hồng cầu hoăc 4 – 6 tiên mao trùng nhiễm ký sinh trùng (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2011) chúng tôi xếp thành 3 mức nhiễm sau:
+ Trung bình 1 vi trường kính hiển vi có 1 hồng cầu nhiễm hoặc 1 tiên mao trùng được coi là nhiễm nhẹ và ký hiệu: (+).
+ Trung bình 1 vi trường kính hiển vi có 2 đến 3 hồng cầu nhiễm hoặc 2 đến 3 tiên mao trùng được coi là nhiễm trung bình và ký hiệu: (+ +).
+ Trung bình 1 vi trường kính hiển vi có từ 4 đến 6 hồng cầu nhiễm hoặc 4 đến 6 tiên mao trùng được coi là nhiễm nặng và ký hiệu là (+ + +).
- Triệu chứng lâm sàng của gà bệnh được xác định qua quan sát trực tiếp gà bệnh, thu lượm thông tin, mô tả và chụp ảnh.
- Bệnh tích đại thể xác định qua mổ khám gà bệnh, quan sát, mô tả và chụp ảnh.
- Bệnh tích vi thể xác định qua mổ khám gà bệnh, thu thập gan, lách, phổi theo phương pháp mổ khám từ tài liệu chuẩn ngành Thú Y.
- Làm tiêu bản vi thể theo phương pháp của Jones et al. (1969).
- Phân tích các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh bằng máy phân tích huyết học CD - 3700.
- Đánh giá sự biến động các chỉ tiêu máu gà bệnh và gà khỏe thông qua sự tăng hoặc giảm của các chỉ tiêu theo dõi giữa gà bệnh và gà khỏe.
- Thử nghiệm hiệu lực của thuốc qua thí nghiệm phân lô và so sánh - Đánh giá hiệu lực của thuốc qua tỷ lệ (%) gà khỏi bệnh
3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh vật. Kiểm định sự sai khác bằng phương pháp chi bình phương (X2).
- Tỷ lệ nhiễm tính bằng tỷ lệ (%)
- Tỷ lệ hiệu lực của thuốc tính theo tỷ lệ (%)
- Xác định cường độ nhiễm: tính theo số lượng hồng cầu và bạch cầu nhiễm trung bình trên 3 vi trường kính hiển vi ở độ phóng đại 10 x 100.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH NHIỄM KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG MÁU LEUCOCYTOZOON TRÊN GÀ LEUCOCYTOZOON TRÊN GÀ
4.1.1. Thành phần loài ký sinh trong máu gà tại các địa điểm nghiên cứu
Để xác định thành phần loài ký sinh trùng ký sinh trong máu gà ở địa bàn nghiên cứu, chúng tôi tiến hành lấy máu của 2.880 con gà, làm tiêu bản máu dàn, soi kính hiển vi để định loại. Kết quả định loại được trình bày qua bảng 4.1.
Bảng 4.1. Thành phần loài ký sinh trùng ký sinh trong máu trên đàn gà ở huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh
Ký sinh trùng Nơi ký sinh Phương pháp phát hiện Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính
Tài liệu phân loại Leucocytozoon spp. Hồng cầu, bạch cầu Tiêu bản máu đàn 2.880 548 Gerald D. Schmidt & Larry
S. Roberts (2009), Sambon, (1908) Trịnh Văn Thịnh, (1963) Plasmodium spp. Hồng cầu 0 Haemoproteus spp. Hồng cầu 0 Trypanosoma spp. Huyết tương 0
Kết quả bảng 4.1 cho thấy, gà nuôi tập trung ở khu vực nghiên cứu chỉ nhiễm một giống ký sinh trùng đường máu là Leucocytozoon. Chúng tôi chưa phát hiện thấy các giống; Plasmodium, Haemoproteus và Trypanosoma.
Mô tả giống Leucocytozoon
Giống Leucocytozoon phát triển trong gà qua nhiều giai đoạn khác nhau, trong máu gà thường gặp chúng trong hồng cầu và bạch cầu.
- Trong hồng cầu:
Giai đoạn giao bào (Gametocytes) làm sưng, làm biến dạng hồng cầu + Hồng cầu vót nhọn và kéo dài ở 2 đầu
- Trong bạch cầu:
+ Giai đoạn giao bào (Gametocytes) làm bạch cầu sưng to có hình giống như quả bóng đá.
Hình 4.1. Hồng cầu và bạch cầu nhiễm Leucocytozoon spp
So sánh với mô tả của Schmidt and Larry S. Roberts (2009) và Trịnh Văn Thịnh, (1963), chúng tôi xác nhận ký sinh trùng gây bệnh cho gà trong vùng nghiên cứu là giống Leucocytozoon.
Phân loại dựa vào hình thái của ký sinh trùng, hình thái của hồng cầu, bạch cầu trong máu gà qua tiêu bản máu cho tới nay vẫn là phương pháp phân loại nhanh nhất các ký sinh trùng đường máu ở gà trong sản xuất nhưng hạn chế của phương pháp này là chỉ xác định được tới giống ký sinh trùng.
Nghiên cứu ký sinh trùng đường máu ở gà ở miền Trung, Đông Nam Bộ, và Bắc bộ, các tác giả Lê Đức Quyết (2009) ; Hoàng Thạch (2004) ; Lâm Thị Thu Hương (2005) ; Lê Văn Năm (2011) ; Nguyễn Văn Sửu (2012) đã phát hiện thấy 1 giống là Leucocytozoon, ở Tây Nam Bộ, Nguyễn Hữu Hưng (2011), đã phát hiện 2 giống là Leucocytozoon và Haemoproteus trong máu gà.
Trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện thấy giống Leucocytozoon. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của các tác giả Lê Đức Quyết (2009) ; Hoàng Thạch (2001) ; Lâm Thị Thu Hương (2005) ; Lê Văn Năm (2011) ; Nguyễn Văn Sửu (2012). Nghiên cứu của chúng tôi ít hơn của Nguyễn