2.3.1. Ké hoa vàng
Cây ké hoa vàng mọc hoang rất phổ biến ờ khắp nơi Việt Nam, còn mọc ở Campuchia, Lào, Ấn Độ, Inđônêxia, Trung Quốc (miền Nam và Hải Nam), Malaixia.
Còn gọi là ké đầu ngựa đồng tiền, bạch bối hoàng hoa nhậm, chỗi đực, khát bo lương (Thái).
Tên khoa học Sida rhomhifolia L.(Sida alnifolia Lour).
Thuộc họ Bông Malvaceae.
Hình 2.10. Ké hoa vàng
Cây nhỏ mọc thẳng đứng, cao 0.5-1m, thân và cành có nhiều lông ngắn hình sao. Lá hình trứng hay gần như hình trứng, đầu hơi nhọn ngắn, mép hơi răng cưa, dài 1.5-4cm, rộng 1-2.5cm, cuống dài 3-5mm, rất nhiều lông. Hoa màu vàng, mọc ở kẽ lá hay đầu cành, đài hình chuông lá đài có lông màu trắng nhạt ở phía ngoài. Cánh trắng màu vàng cũng có lông mịn. Nhụy 20, nhụy có 7 vòi, quả có vỏ mỏng dễ vỡ, ở đỉnh có lông, phía lưng có hai vệt nổi. Hạt cũng có lông.
Ké hoa vàng còn là một vị thuốc dùng trong nhân dân để làm vị thuốc mát, trị các bệnh nhiễm khuẩn nói chung, đặc biệt có công dụng tốt trong chữa mụn nhọt, sưng chín mé, chữa lỵ, tiểu tiện nóng đỏ hay vàng đậm, sốt, lỵ. Dùng tươi hay sấy khô.
2.3.2. Khổ sâm
Cây khổ sâm mọc hoang và thường được trồng ở nhiều nơi, chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam.
Trong dân gian còn gọi là Khổ sâm Bắc bộ, cây cù đèn, cây co chạy đón (dân tộc Thái).
Khổ sâmcó tên khoa học là Cronton tonkinensis Gagnep.
Họ Thầu dầu – Euphorbiaceae.
Hình 2.11. Khổ sâm
Nguồn: https://thoaihoacotsong.vn/cac-bai-thuoc-nam-hay/tac-dung-cay-kho-sam-cho- la-cay-kho-sam-cho-la-tri-ung-nhot-viem-loet-da-day/
Cây khổ sâm nhỏ cao 0,7 – 1,0m, lá mọc cách hoặc hơi so le, cả hai mặt lá đều có nhiều lông hình khiên óng ánh, khi phơi khô mặt dưới lá có màu trắng bạc, mặt trên có màu nâu đen. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành.
Thành phần hóa học chính của cây bao gồm Flavonoid, alkaloid, tannin và polyphenol, dân gian thường sử dụng loại cây này để sát khuẩn, trị ung nhọt, kiết lỵ, viêm loét dạ dày, thành tá tràng, đầy bụng, khó tiêu.
2.3.3. Nghệ
Nghệ còn có tên là uất kim, khương hoàng, safran des Indes.
Tên khoa học Curcuma longa L. (Curcuma domestica Lour.).
Thuộc họ Gừng Zingiheraceae.
Ta dùng thân rê cây nghệ gọi là khương hoàng (Rhizoma Curcumae longae)
và rễ củ gọi là uất kim (Radix Curcumae longae).
Hình 2.12. Củ nghệ
Nguồn: https://www.dieutri.vn/caythuocthongtieuthongmat/18-9-2015/S7282/Cay- nghe.htm
Nghệ là một loạithực vật thân thảo lâu năm, mà có thể đạt đến chiều cao 1
mét. Cây tạo nhánh cao, có màu vàng cam, hình trụ, vàthân rễcó mùi thơm. Các lá
mọc xen kẽ và xếp thành hai hàng. Chúng được l thành bẹ lá, cuống lá và phiến
lá.Từ các bẹ lá, thân giả được hình thành. Cuống lá dài từ 50 – 115 cm. Các phiến lá
đơn thường có chiều dài từ 76 – 115 cm và hiếm khi lên đến 230 cm. Chúng có chiều rộng từ 38 – 45 cm và có dạng hình thuôn hoặc elip và thu hẹp ở chóp.
Các thành phần hóa học quan trọng nhất của nghệ là một nhóm các hợp chất được gọi là curcuminoid, trong đó bao gồm curcumin (diferuloylmethane), demethoxycurcumin, và bisdemethoxycurcumin. Hợp chất được nghiên cứu
nhiều nhất là curcumin, tạo thành 3.14% (theo lượng trung bình) bột nghệ.Ngoài
ra còn có các loạitinh dầuquan trọng khác như turmerone, atlantone, và
zingiberene. Một số thành phần khác là các loại đường, proteinvà nhựa. Củ nghệ
chứa khoảng 5% tinh dầu và đến 5% curcumin, một dạng polyphenol. Curcumin là hoạt chất chính trong củ nghệ, với kí hiệu C.I. 75300, hay Natural Yellow 3. Tên hóa học của nó là(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6- heptadien-3,5-dion.
Với thành phần hóa học chủ yếu chứa curcumin (một dạng polyphenol), củ nghệ được biết như có tính vượt trội trong kháng viêm, đặc biệt có khả năng kháng khuẩn với trực khuẩn E.coli, staphylococcus aureus, klebsiella và pseudomonas…
2.3.4. Thồm lồm
Cây thồm lồm mọc hoang ờ khắp nơi trong nước ta, thường ít được dùng, hay một số nơi người ta dùng lá tươi gíã hay nhai nhỏ đắp lên nơi tai bị loét gọi là bệnh thồm lồm ăn tai. Trâu bò thích ăn vì thân cây có vị ngọt.
Còn gọi là đuôi tôm, mía gíò, bẻm, mía bẻm, mía nung, cây lôm, chuồng chuồng, hỏa khôi mẫu, săm koy (Luang Prabang).
Tên khoa học Polygonum sinense L.
Thuộc họ Rau răm Polygonaceơe.
Hình 2.13. Cây thồm lồm
Cây thảo sống dai, thân đứng, nhiều khi mọc rất dài và leo, có rãnh dọc. Lá hình bầu dục hay hơi thuôn, phía cuống lá bầu bầu, ngọn lá hẹp nhọn, lá phía trên nhỏ hơn và gần như không cuống và ôm vào thân, cuống ngấn, ở phía dưới có hai tai nhỏ tròn, bẹ chìa mòng và ngấn hơn các dóng của thân. Cụm hoa thành đầu họp thành xim ngù tân cùng, có cuống phủ rất nhiều lông có hạch tiết, quả ba cạnh thuôn dài.
Trong dân gian người dân thường giã tươi cây (thân, lá cành) đắp vào vết loét chỗ tổn thương để chống viêm, chống nhiễm khuẩn.
2.3.5. Thầu dầu
Thầu dầu còn có tên gọi khác đu đủ dầu, đu đủ tía.
Tên khoa học: Ricinus communis L.
Thuộc họ Thầu dầu - Euphorbiaceae.
Hình 2.14.Thầu dầu
Nguồn: https://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thaudau.htm
Cây thầu dầu là cây thân nhỏ cao tới 4-5m, vỏ có màu sắc khác nhau, các cành non đều có phấn trắng bao phủ ngoài. Lá lớn, có thùy chân vịt sâu, mét lá có răng cưa, cuống dài, có tuyến. Ra hoa tháng 3-7, có quả tháng 4-8. Cụm hoa ở ngọn hay ở nách lá, thành chùy, hoa đực ở phía dưới, hoa cái ở trên, có nhiều lá bắc phủ ở ngoài. Quả nang màu lục hay màu tím nhạt, có gai mềm, chứa 3 hạt. Hạt hình bầu dục, có bề mặt nhẵn, màu nâu xám có vân đỏ hay nâu đen.
Hạt Thầu dầu chứa 40-50% dầu, 25% chất albuminosid, một chất có tinh thể và nitrogen (ricidin), acid malic đường, muối, cellulose, ricin và ricinin, các men trong đó có men lipase. Dầu chiết xuất lạnh từ hạt chứa nhiều chất hữu cơ có gốc là glycerin (50-60% trong đó có stearin cholesterin, palmitin, ricinolein) và acid béo (acid linoleic, oleic và stearic). Chất ricin là một protein độc ở trong hạt, chất này biến mất khi bị ép, vì nó nằm lại trong khô dầu. Dầu thầu dầu là một chất lỏng dính, có mùi khó chịu gây nôn mửa, nó có tính nhuận tràng và xổ. Tác dụng này khá nhanh, không gây kích thích ống tiêu hoá.
Người ta còn sử dụng lá thầu dầu để trị liệu các chứng bệnh ngoài da như: da viêm mủ, eczema, mẩn ngứa, ung nhọt, hay các bệnh viêm tuyến vú, viêm đa khớp, diệt dòi, diệt bọ gậy.
2.3.6. Đơn buốt
Đơn buốt còn gọi là đơn kim, quỷ trâm thảo, manh tràng thảo, tử tô hoang, cúc áo.
Tên khoa học Bidens pilosa L.
Thuộc họ Cúc Asteraceae.
Hình 2.15. Cây đơn buốt
Nguồn: https://www.dieutri.vn/caythuocmanngua/18-8-2015/S7193/Cay-don-buot.htm
Đơn buốt là một loại cỏ mọc hằng năm, thân cao 0.4-1m. Thân và cành đều có những rãnh chạy dọc, có lông. Lá mọc đối, cuống dài, phiến lá kép gồm 3 lá chét.
Lá chét hình mác, phía đáy hơi tròn, cuống ngắn, mép lá chét có răng cưa to thô. Cụm hoa hình đầu, màu vàng, mọc ở nách lá hay ở đầu cành, mọc đơn độc hay từng đôi một. Quả hình thoi, 3 cạnh không đều, dài 1cm, trên có rãnh chạy dọc.
Trong dân gian, thường sử dụng cây đơn buốt để đun lấy nước tắm trị bệnh mẩn ngứa, bã xát kỹ lên vết mẩn, thường chỉ dùng 1-2 lần là thấy kết quả. Ngoài
PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thu mẫu nguyên liệu thảo dược tại tỉnh Thái Nguyên.
- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Tách chiết thô thảo dược.
- Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản miền Bắc (CEDMA), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1: Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm của một số loại thảo dược.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Nguồn vật liệu (chiết phẩm thô) được cung cấp bởi Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Sản phẩm bao gồm 6 loại ở dạng chiết phẩm thô, chi tiết được mô tả trong bảng sau:
Bảng 3.1. Danh mục thảo dược được chiết xuất dạng thô sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mẫu Ký hiệu Bộ phận cây KL (g)
1 Ké hoa vàng M1 Thân cành lá 33
2 Khổ sâm M2 Lá 20
3 Nghệ M3 Củ 45
4 Thồm lồm M4 Thân cành lá 26
5 Thầu dầu M5 Lá 23
6 Đơn buốt M6 Thân cành lá 29
- Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020 gây bệnh AHPND được lưu
giữ -80oC tại Trung tâm Quan trắc Môi trường và bệnh thủy sản miền Bắc (CEDMA),
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 (RIA1) được dùng để thử nghiệm.
- Đĩa giấy thấm vô trùng do công ty TNHH Nam Khoa sản xuất. Kháng sinh Doxycycline (30µg) và khoanh tẩm DMSO làm đối chứng.
- Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt) chọn lọc cho vi khuẩn
Vibrio. Môi trường Nutrient Broth (NB) bổ sung 2% NaCl để nuôi cấy tăng
sinh, Mueller Hinton Agar (MHA) bổ sung 2% NaCl dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn.
- Tôm thẻ chân trắng có trọng lượng khoảng 3 gram/con, có cỡ đồng đều phản xạ nhanh, đồng thời được xác định âm tính với chỉ tiêu bệnh virus đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHV), và hoại tử gan tụy cấp ( AHPND).
- Bể composit có thể tích 300 lít.
- Các vật dụng cần thiết khác (sục khí, vợt, …..). - Thức ăn tôm.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác nhận chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND trên tôm bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
- Xác định hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây AHPND trên tôm.
- Xác định hoạt tính của dịch chiết thô trong phòng trị bệnh AHPND ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Xác định hoạt tính của dịch chiết thô trong phòng trị bệnh AHPND trên tôm ở quy mô thực nghiệm (pilot).
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020
bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Chuẩn bị vi khuẩn gây bệnh AHPND: Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020 được cấy ria hình chữ chi trên đĩa thạch TCBS, lấy 1 lượng vi khuẩn
bằng khoảng một khuẩn lạc nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 28oC trong 18h để thu được
lượng vi khuẩn đủ lớn phục vụ thí nghiệm. Mật độ vi khuẩn được xác định theo
phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng = 600 nm, kiểm tra lại bằng
phương pháp pha loãng và định lượng trên đĩa thạch. Mật độ vi khuẩn thử
nghiệm là 108 cfu/ml.
Để khẳng định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020 được lựa chọn để thử nghiệm là chủng gây bệnh AHPND, ADN được tách chiết từ môi trường NB (Nutrient Broth) nuôi cấy vi khuẩn và sử dụng như nguồn ADN khuôn mẫu cho
phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi AP3 (Sirikharin et al., 2014)
(F:ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC và R:
GTGGTAATAGATTGTACAGAA) khuếch đại đoạn gen 336 bp. Chu kỳ nhiệt của
phản ứng PCR được áp dụng như sau: Giai đoạn tiền biến tính ở 94oC trong 5 phút,
theo sau với 35 chu kỳ nhiệt gồm giai đoạn biến tính trong 1 phút ở 94oC, giai đoạn
bắt cặp trong 30 giây ở 53oC và giai đoạn tổng hợp trong 40 giây ở 72oC, và kết thúc
với một giai đoạn kéo dài trong 5 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR được điện di trên
3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm
3.4.2.1. Chuẩn bị sản phẩm chiết phẩm thô thử nghiệm
Thu dịch chiết thô thảo dược:Mẫu cây được để nơi thoáng mát, sau đó sấy
khô ở nhiệt độ 40-50oC đến khối lượng không đổi. Nghiền nhỏ mẫu và ngâm
chiết 5 lần với dung môi ethanol ở nhiệt độ thường. Các dịch chiết thu được đem
dồn lại và cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 50oC để thu được cặn
chiết thô ethanol.
Sản phẩm chiết thô từ 6 loại thảo dược nêu trên được tính toán từ nồng độ thấp đến nồng độ cao và được pha trong dung môi DMSO theo bảng mô tả sau:
Bảng 3.2. Nồng độ mỗi loại chiết phẩm thô trong khoanh giấy lập kháng sinh đồ
TT Tỷ lệ
(dịch chiết thô:DMSO)
Lượng dịch chiết
thô/khoanh giấy tẩm (µg) Ghi chú
1 10µg : 1µl 200 20µl là thể tích được sử dụng nhỏ lên khoanh giấy thử kháng sinh đồ trong nghiên cứu 2 10µg : 3µl 66,7 3 10µg : 5µl 40 4 10µg : 9µl 22,2 5 Kháng sinh Doxycycline 30
3.4.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chiết phẩm thô thảo dược
Hoạt tính kháng khuẩn của 6 sản phẩm thảo dược chiết xuất thô được kiểm tra bằng phương pháp lập kháng sinh đồ trên đĩa thạch của Kirby-Bauer, sử dụng môi trường MHA (bổ sung 2% NaCl).
Chủng vi khuẩn dùng thử nghiệm (nồng độ 108 cfu/ml) được trang đều trên
các đĩa thạch MHA. 20µl sản phẩm dịch chiết thô + DMSO tương ứng với các hàm lượng dịch chiết thô lựa chọn thử nghiệm nêu trên bảng 3.2 được nhỏ trên các đĩa giấy thấm vô trùng rồi đặt trên đĩa thạch đã được trang vi khuẩn, tương tự đối chứng DMSO cũng được đặt lên đĩa trang vi khuẩn. Đĩa thạch sau đó được ủ
trong tủ ấm 27-29oC, sau 24h nuôi cấy, đĩa thạch được lấy ra để đo đường kính
vòng vô khuẩn.
Đo đường kính vòng vô khuẩn (mm): Dựa vào đường kính của vòng vô khuẩn theo tài liệu “The Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI (former NCCLS M31-A2), 2006) để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm nano SP2 thử nghiệm. Nếu:
+ Đường kính vòng vô khuẩn 11 mm: Vi khuẩn kháng kháng sinh. + Đường kính vòng vô khuẩn 12-15 mm: Trung bình.
+ Đường kính vòng vô khuẩn 16 mm: Nhạy (Kháng sinh có độ nhạy với
vi khuẩn). Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì độ nhạy càng cao.
3.4.3. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm
Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô bằng phương pháp lập kháng sinh đồ nêu trên là cơ sở để lựa chọn ra 02 loại thảo dược và nồng độ tương ứng để triển khai tiếp thí nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm ướt. 02 loại thảo dược được lựa chọn là: Thồm lồm (M4) và Thầu dầu (M5).
Bảng 3.3. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô đối với bệnh AHPND ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm Công thức 1 Công thức 2 Đối chứng âm Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Đối chứng dương Thí nghiệm 3 Thí nghiệm 4 Đối chứng dương
Chất bổ sung Dịch chiết thô thảo dược
Thức ăn thường. Không có chất bổ sung
Dịch chiết thô thảo dược
Thức ăn thường. Không có chất bổ sung Không có bất kỳ tác động nào của dịch chiết thô thảo dược và vi khuẩn. Tôm nuôi bình thường Liều sử dụng M4 25 g/100 kg tôm 30 g/100 kg tôm 25 g/m 3 30 g/m3 M5 35 g/100 kg tôm 40 g/100 kg tôm 35 g/m 3 40 g/m3 Cách dùng
Cho tôm ăn thức ăn bổ sung thảo dược trong 7 ngày liên
tục
Bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào 2 lần, lần 1 - cùng lúc với công cường độc V.
parahaemolyticus và lần 2 -
cách lần 1 là 24 h Thời gian công cường độc V.
parahaemolyticus Ngày thứ 7 Ngày thứ 1
Mật độ V. parahaemolyticus
công cường độc (cfu/ml) 10
5-106 105-106
Các bể thí nghiệm được bố trí lặp lại 2 lần và được theo dõi ghi chép số tôm chết tích lũy theo thời gian và tái phân tích tác nhân vi khuẩn gây bệnh AHPND bằng kỹ thuật PCR
3.4.3.1. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết thô trộn vào thức ăn cho tôm ăn
- Tôm thí nghiệm có kết quả âm tính với chỉ tiêu phân tích virus (WSSV,