Phần 3 Phương pháp nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro
invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm
3.4.2.1. Chuẩn bị sản phẩm chiết phẩm thô thử nghiệm
Thu dịch chiết thô thảo dược:Mẫu cây được để nơi thoáng mát, sau đó sấy
khô ở nhiệt độ 40-50oC đến khối lượng không đổi. Nghiền nhỏ mẫu và ngâm
chiết 5 lần với dung môi ethanol ở nhiệt độ thường. Các dịch chiết thu được đem
dồn lại và cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 50oC để thu được cặn
chiết thô ethanol.
Sản phẩm chiết thô từ 6 loại thảo dược nêu trên được tính toán từ nồng độ thấp đến nồng độ cao và được pha trong dung môi DMSO theo bảng mô tả sau:
Bảng 3.2. Nồng độ mỗi loại chiết phẩm thô trong khoanh giấy lập kháng sinh đồ
TT Tỷ lệ
(dịch chiết thô:DMSO)
Lượng dịch chiết
thô/khoanh giấy tẩm (µg) Ghi chú
1 10µg : 1µl 200 20µl là thể tích được sử dụng nhỏ lên khoanh giấy thử kháng sinh đồ trong nghiên cứu 2 10µg : 3µl 66,7 3 10µg : 5µl 40 4 10µg : 9µl 22,2 5 Kháng sinh Doxycycline 30
3.4.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chiết phẩm thô thảo dược
Hoạt tính kháng khuẩn của 6 sản phẩm thảo dược chiết xuất thô được kiểm tra bằng phương pháp lập kháng sinh đồ trên đĩa thạch của Kirby-Bauer, sử dụng môi trường MHA (bổ sung 2% NaCl).
Chủng vi khuẩn dùng thử nghiệm (nồng độ 108 cfu/ml) được trang đều trên
các đĩa thạch MHA. 20µl sản phẩm dịch chiết thô + DMSO tương ứng với các hàm lượng dịch chiết thô lựa chọn thử nghiệm nêu trên bảng 3.2 được nhỏ trên các đĩa giấy thấm vô trùng rồi đặt trên đĩa thạch đã được trang vi khuẩn, tương tự đối chứng DMSO cũng được đặt lên đĩa trang vi khuẩn. Đĩa thạch sau đó được ủ
trong tủ ấm 27-29oC, sau 24h nuôi cấy, đĩa thạch được lấy ra để đo đường kính
vòng vô khuẩn.
Đo đường kính vòng vô khuẩn (mm): Dựa vào đường kính của vòng vô khuẩn theo tài liệu “The Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI (former NCCLS M31-A2), 2006) để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm nano SP2 thử nghiệm. Nếu:
+ Đường kính vòng vô khuẩn 11 mm: Vi khuẩn kháng kháng sinh. + Đường kính vòng vô khuẩn 12-15 mm: Trung bình.
+ Đường kính vòng vô khuẩn 16 mm: Nhạy (Kháng sinh có độ nhạy với
vi khuẩn). Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì độ nhạy càng cao.