Phần 3 Phương pháp nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.4.3. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch
dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm
Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô bằng phương pháp lập kháng sinh đồ nêu trên là cơ sở để lựa chọn ra 02 loại thảo dược và nồng độ tương ứng để triển khai tiếp thí nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm ướt. 02 loại thảo dược được lựa chọn là: Thồm lồm (M4) và Thầu dầu (M5).
Bảng 3.3. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô đối với bệnh AHPND ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm Công thức 1 Công thức 2 Đối chứng âm Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Đối chứng dương Thí nghiệm 3 Thí nghiệm 4 Đối chứng dương
Chất bổ sung Dịch chiết thô thảo dược
Thức ăn thường. Không có chất bổ sung
Dịch chiết thô thảo dược
Thức ăn thường. Không có chất bổ sung Không có bất kỳ tác động nào của dịch chiết thô thảo dược và vi khuẩn. Tôm nuôi bình thường Liều sử dụng M4 25 g/100 kg tôm 30 g/100 kg tôm 25 g/m 3 30 g/m3 M5 35 g/100 kg tôm 40 g/100 kg tôm 35 g/m 3 40 g/m3 Cách dùng
Cho tôm ăn thức ăn bổ sung thảo dược trong 7 ngày liên
tục
Bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào 2 lần, lần 1 - cùng lúc với công cường độc V.
parahaemolyticus và lần 2 -
cách lần 1 là 24 h Thời gian công cường độc V.
parahaemolyticus Ngày thứ 7 Ngày thứ 1
Mật độ V. parahaemolyticus
công cường độc (cfu/ml) 10
5-106 105-106
Các bể thí nghiệm được bố trí lặp lại 2 lần và được theo dõi ghi chép số tôm chết tích lũy theo thời gian và tái phân tích tác nhân vi khuẩn gây bệnh AHPND bằng kỹ thuật PCR
3.4.3.1. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết thô trộn vào thức ăn cho tôm ăn
- Tôm thí nghiệm có kết quả âm tính với chỉ tiêu phân tích virus (WSSV, YHV và Taura) và AHPND. Sau khi có kết qủa âm tính với chỉ tiêu nêu trên, tôm lựa chọn được chuyển về phòng thí nghiệm ướt, nuôi thuần trong 7 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Cỡ tôm: khoảng 3gram/con. Mỗi bể thả 20 con.
- Một dịch chiết thô được thử 2 nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. M4 sử dụng 2 nồng độ bao gồm 25g dịch chiết thô/100kg tôm và 30g dịch chiết thô/100kg tôm, M5 sử dụng 2 nồng độ (35g dịch chiết thô/100kg tôm và 40g dịch chiết thô/100kg tôm).
- Lô đối chứng âm: Tôm được ăn thức ăn không chứa thảo dược và theo dõi đến khi kết thúc thí nghiệm.
- Lô đối chứng dương: Tôm được ăn thức ăn không chứa thảo dược, và tôm được công cường độc vi khuẩn ở ngày thứ 7.
- Thức ăn được trộn với sản phẩm dịch chiết thô thảo dược sau đó được bao bởi dầu gan mực để kích thích tôm ăn.
- Đến ngày thứ 7, tất cả lô thí nghiệm tôm cho ăn dịch chiết thô và đối chứng dương được công cường độc vi khuẩn (tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp).
- Công cường độc VK bằng hình thức ngâm với mật độ vi khuẩn giao động
trong khoảng 105- 106cfu/ml.
- Các lô thí nghiệm sau khi công cường độc vi khuẩn, tôm có dấu hiệu yếu, được thu tái phân tích vi khuẩn AHPND.
3.4.3.2. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết thô bổ sung vào môi trường nước
- Tôm thí nghiệm có kết quả âm tính với chỉ tiêu phân tích virus (WSSV, YHV và Taura) và AHPND. Sau khi có kết qủa âm tính với chỉ tiêu nêu trên, tôm lựa chọn được chuyển về phòng thí nghiệm ướt, nuôi thuần trong 7 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Cỡ tôm: khoảng 3gram/con. Mỗi bể thả 20 con.
- Một dịch chiết thô được thử 2 nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. M4 sử
dụng 2 nồng độ bao gồm: 25g/m3 và 30g/m3; M5 sử dụng 2 nồng độ bao gồm:
- Số lần cho dịch chiết thô M4 và M5 vào nước là 2 lần, lần 1 tại thời điểm bắt đầu công cường độc và lần 2 cách lần 1 là 24h.
- Lô đối chứng dương: tại thời điểm công cường độc vi khuẩn lên tôm, bổ sung nước muối (NaCl 2%) khử trùng vào bể.
- Lô đối chứng âm: Không có bất kỳ tác động nào, tôm nuôi dưỡng bình thường. - Công cường độc vi khuẩn bằng hình thức ngâm với mật độ vi khuẩn giao
động trong khoảng 105- 106cfu/ml.
3.4.4. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong quy mô thực nghiệm (pilot) dịch chiết thô trong quy mô thực nghiệm (pilot)
Từ kết quả thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của chế phẩm trong điều kiện phòng thí nghiệm nêu trên là cơ sở để lựa chọn ra 01 loại thảo dược và nồng độ tương ứng triển khai tiếp thí nghiệm ở quy mô thực nghiệm (pilot). Thảo dược được lựa chọn là: Thồm lồm (M4).
Bảng 3.4. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô thồm lồm đối với bệnh AHPND ở tôm quy mô thực nghiệm (pilot) Nội dung Công thức 1 Công thức 2 Đối chứng âm Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Thí nghiệm 3 Đối chứng dương Thí nghiệm 4 Đối chứng dương
Chất bổ sung Dịch chiết thô thồm lồm
Thức ăn thường. Không có chất bổ sung Dịch chiết thô thồm lồm Thức ăn thường. Không có chất bổ sung Không có bất kỳ tác động nào của dịch chiết thô thảo dược và vi khuẩn. Tôm nuôi bình thường Liều sử dụng 25g/100kg tôm và 30 g/100 kg tôm 25g/m3 và 30 g/m3
Thời gian công cường độc V.
Parahaemolyticus Ngày thứ 8 Ngày thứ 8
Ngày thứ 1/cùng thời điểm cho tôm ăn thức ăn chứa chế phẩm
Ngày thứ 1/cùng thời điểm cho chế phẩm vào nước lần 1
Cách dùng
Cho tôm ăn thức ăn bổ sung thảo dược trong 7 ngày liên tục
Cho tôm ăn thức ăn bổ sung thảo dược trong 7 ngày liên tục. Sau khi công cường độc vi khuẩn tiếp tục cho ăn chể phẩm 7 ngày
Cho tôm ăn thức ăn bổ sung thảo dược trong 7 ngày liên tục
Bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào 2 lần, lần 1 - cùng lúc với công cường độc V. parahaemolyticus và lần 2 - cách lần 1 là 24 h Mật độ V. parahaemolyticus công cường độc (cfu/ml) 105-106
Các bể thí nghiệm được bố trí lặp lại 2 lần và được theo dõi ghi chép số tôm chết tích lũy theo thời gian và tái phân tích tác nhân vi khuẩn gây bệnh HPND bằng kỹ thuật PCR
Công thức 1 (Bảng 3.4) gồm 3 thí nghiệm liên quan đến bổ sung chế phẩm vào thức ăn, công thức 2 gồm 1 thí nghiệm liên quan đến cách thức bổ sung chế phẩm vào nước. Mỗi thí nghiệm bố trí 2 nồng độ thử nghiệm khác nhau và lặp lại 2 lần, kèm theo thí nghiệm âm và dương tương ứng. Tất cả bể thí nghiệm bố trí trong điều kiện độ mặn 10-12‰, cỡ tôm 3-5g/con
3.4.4.1. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết thô trộn vào thức ăn cho tôm ăn
- Tôm thí nghiệm có kết quả âm tính với chỉ tiêu phân tích virus (WSSV, YHV và Taura) và AHPND. Sau khi có kết qủa âm tính với chỉ tiêu nêu trên, tôm lựa chọn được chuyển về phòng thí nghiệm ướt, nuôi thuần trong 7 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Cỡ tôm: khoảng 3gram/con. Mỗi bể thả 100 con.
- Dịch chiết thô được thử 2 nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. M4 sử dụng 2 nồng độ bao gồm 25g dịch chiết thô/100kg tôm và 30g dịch chiết thô/100kg tôm.
- Lô đối chứng âm: Tôm được ăn thức ăn không chứa thảo dược và theo dõi đến khi kết thúc thí nghiệm.
- Lô đối chứng dương: Tôm được ăn thức ăn không chứa thảo dược, và tôm được công cường độc vi khuẩn ở ngày thứ 7.
- Thức ăn được trộn với sản phẩm dịch chiết thô thảo dược sau đó được bao bởi dầu gan mực để kích thích tôm ăn.
- Đến ngày thứ 7, tất cả lô thí nghiệm tôm cho ăn dịch chiết thô và đối chứng dương được công cường độc vi khuẩn (tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp).
- Công cường độc vi khuẩn bằng hình thức ngâm với mật độ vi khuẩn giao
động trong khoảng 105- 106cfu/ml.
- Các lô thí nghiệm sau khi công cường độc vi khuẩn, tôm có dấu hiệu yếu, được thu tái phân tích vi khuẩn AHPND bằng kỹ thuật PCR.
3.4.4.2. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết thô bổ sung vào môi trường nước
- Tôm thí nghiệm có kết quả âm tính với chỉ tiêu phân tích virus (WSSV, YHV và Taura) và AHPND. Sau khi có kết qủa âm tính với chỉ tiêu nêu trên, tôm lựa chọn được chuyển về phòng thí nghiệm ướt, nuôi thuần trong 7 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
- Dịch chiết thô được thử 2 nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. M4 sử dụng
2 nồng độ bao gồm: 25g/m3 và 30g/m3.
- Số lần cho dịch chiết thô M4 vào nước là 2 lần, lần 1 tại thời điểm bắt đầu công cường độc và lần 2 cách lần 1 là 24h.
- Lô đối chứng dương: tại thời điểm công cường độc vi khuẩn lên tôm, bổ sung nước muối (NaCl 2%) khử trùng vào bể.
- Lô đối chứng âm: Không có bất kỳ tác động nào, tôm nuôi dưỡng bình thường. - Công cường độc vi khuẩn bằng hình thức ngâm với mật độ vi khuẩn giao
động trong khoảng 105- 106cfu/ml.
- Các bể thí nghiệm được bố trí lặp lại 2 lần và được theo dõi ghi chép số tôm chết tích lũy theo thời gian và tái phân tích tác nhân vi khuẩn gây bệnh AHPND bằng kỹ thuật PCR.