Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.2.1. Phương pháp nấu môi trường
* Môi trường PGA (Potato- Glucose- Agar)
Thành phần: + Khoai tây 200 g + Glucose 20 g
+ Agar 20 g + Nước cất 1000 ml
Cách điều chế: khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái lát mỏng cho vào nồi cùng với 1000 ml nước cất đun sôi khoảng 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều cho agar tan hết, đun cho đến khi sôi. Cho môi trường này vào bình tam giác đậy nắp bằng giấy bạc, sau đó đem hấp khử
trùng ở 1210C (1,5 atm) trong vòng 45 phút. Để nguội 55 - 600C trước khi rót ra đĩa petri đã khử trùng.
*Môi trường WA (Nước – Agar) Thành phần: + Agar: 20gam + Nước cất: 1000ml
Cách làm: Cho 1000ml nước vào xoong, hòa Agar vào 1000ml nước, dùng đũa khuấy cho Agar tan đều, cho lên bếp điện đun, vừa đun vừa khuấy đều tay, sau khi sôi 2 phút cho xoong ra khỏi bếp, đổ môi trường cho vào chai thủy tinh của hãng PYREX, vặn nắp vừa phải (không vặn chặt quá), cho vào nồi hấp, hấp khử trùng 15 phút. Hấp xong, lấy lọ môi trường ra khỏi nồi hấp, đổ môi trường vào các hộp lồng, đổ ít rồi lắc cho môi trường loang thành lớp rất mỏng trong hộp lồng, đậy nắp lại, khi môi trường nguội, nếu có cấy nấm luôn hay không đều phải bọc màng polyetylen để chống nhện và côn trùng, cất vào tủ để sử dụng dần.
*Môi trường PSA (Khoai tây – Đường saccarose – Agar) Thành phần: + Khoai tây : 200gam
+ Saccarose (đường ăn) : 20gam + Agar : 20gam + Nước cất : 1000ml
Cách làm: 200g khoai tây gọt sạch vỏ, cắt lát mỏng luộc nhừ với 1 lít nước, sau đó lọc qua 4 lớp vải màn lấy nước trong. Cho nước khoai tây, đường ăn, agar vào xoong và khuấy đều. Cho xoong lên bếp vừa đun vừa khuấy đều rồi đổ vào lọ thủy tinh của hãng PYREX hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, hấp xong cho môi trường vào hộp lồng đậy nắp lại, khi môi trường nguội, nếu có cấy nấm luôn hay không đều phải bọc màng polyetylen để chống nhện và côn trùng, để vào khay nhựa, cất vào trong tủ.
3.5.2.2. Phương pháp phân lập nấm
Phân lập theo phương pháp đơn bào tử: Chọn lá có vết bệnh điển hình, rửa sạch dưới vòi nước, dùng giấy lọc vô trùng thấm khô lá, đặt lá trong hộp ẩm, sau 3 ngày bào tử đã hình thành trên vết bệnh cầm đĩa môi trường Agar đã khử trùng úp ngược, dính nhẹ vết bệnh vào mặt Agar để bào tử dính trên mặt Agar. Đưa đĩa lên kính hiển vi, dùng kim thủy tinh để lấy từng bào tử và cấy vào đĩa PSA, khi nấm
mọc cấy truyền vào ống nghiệm PSA nghiêng, gửi nguồn để nghiên cứu.
Kiểm tra vi sinh vật gây bệnh bằng kính hiển vi, xác định đặc điểm hình thái, mầu sắc, kích thước của tản nấm, cành bào tử, bào tử phân sinh và các cơ quan sinh sản của nấm.
3.5.2.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm Cercospora personata trên một số môi trường nhân tạo
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết trong thời kì sinh trưởng mạnh cấy nấm vào những hộp petri trên các môi trường, các đĩa petri được đặt trong điều kiện phòng.
CT1: môi trường PSA CT2: môi trường PGA
CT3: môi trường PSA + lá lạc (100ml PSA + 5 gam lá lạc nghiền nhỏ) CT4: môi trường PGA +lá lạc (100ml PGA + 5 gam lá lạc nghiền nhỏ) - Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri cấy 1 khoanh nấm đường kính 5mm.
- Chỉ tiêu theo dõi
+ Đo đường kính tản nấm sau cấy 7, 14, 28, 42, 63 ngày
+ Đặc điểm hình thái: sợi nấm về kích thước, màu sắc, hình dạng, cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh…..
+ Đặc điểm sinh học: khả năng tồn tại, phát sinh phát triển trên môi trường nhân tạo, khả năng hình thành bào tủ trong các điều kiện khác nhau (giàu dinh dưỡng , nghèo dinh dưỡng)…..
3.5.2.4. Nghiên cứu khả năng nảy mầm của nấm Cercospora personata trên một số môi trường nhân tạo
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết trong thời kì sinh trưởng mạnh cấy nấm vào những hộp petri trên các môi trường, các đĩa petri được đặt trong điều kiện phòng.
CT1: môi trường lá lạc CT2: môi trường PSA
- Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri đường kính 5mm - Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm sau:2, 4, 6, 8, 12, 24 giờ.
3.5.2.5. Nghiên cứu hiệu lực của một số thuốc đối với sự nảy mầm của nấm Cercospora personata và nấm Pucinia arachidis Spegazini