Hình 4.4. Cây phả hệ của các chủng Parvovirus nghiên cứu dựa trên trình tự
Sau khi so sánh mức độ tương đồng về nt và aa giữa những chủng
Parvovirus trong nghiên cứu, dựa vào phần mềm MEGA7 chúng tôi đã tiến hành
xây dựng cây sinh học phân tử để xác định và phân tích nguồn gốc phát sinh của các chủng virus trong nghiên cứu với các chủng Parvovirus tham chiếu khác được lấy từ ngân hàng GenBank.
Kết quả xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nt của gen VP2 của các chủng Parvovirus cho thấy 4 chủng L04, L05, L12, L14 trong nghiên cứu này đều nằm trên cùng 1 nhánh phát sinh với các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó có mối quan hệ gần gũi với các chủng nằm trên Genotype 2c của Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) và chủng của Việt Nam (Genbank: LC214969) (Hình 4.4).
Dựa trên kết quả phân tích mức độ tương đồng nt, aa và kết quả phân tích cây phả hệ cho thấy cả 4 chủng Parvovirus trong nghiên cứu này L04, L05, L12 và L14 đều thuộc Genotype 2c.
4.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CHỦNG PARVOVIRUS TRÊN MÔI TRƢỜNG
NUÔI CẤY TẾ BÀO CRFK
4.3.1. Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK
Tế bào CRFK được phục hồi và thực hiện cấy chuyển xác định mật độ tế bào thích hợp để gây nhiễm với môi trường nuôi cấy DMEM có bổ sung 5% FBS. Một ống giống tế bào CRFK chứa 5x106
tế bào, được lấy ra từ bình Nitơ lỏng nuôi cấy trong một chai T25. Trong quá trình nuôi, mật độ tế bào được ghi chép ở các thời điểm khác nhau. Kết quả quan sát cho thấy tế bào sau 12h bắt đầu bám đáy, sau 24h tế bào vươn dài ra bám vào bề mặt chai. Tế bào có hình dạng thuôn dài, vươn phủ khoảng 80% bề mặt chai sau 48h, và sau 72h tế bào phủ kín, bắt đầu có dấu hiệu già, tế bào chết co tròn và nổi lên.
a) Tế bào 24h b) Tế bào 48h c) Tế bào 72h d) Tế bào 96h
4.3.2. Kết quả phân lập Parvovirus
Kết quả phân tích về phả hệ cho thấy các chủng parvovirus trong nghiên cứu này có sự tương đồng rất cao (gần 100%) về trình tự nt và aa, cùng thuộc Genotype 2c. Ngoài các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, trong nghiên cứu này chủng
parvovirus cũng đã được phân lập thành công trên môi trường tế bào CRFK.
a) ĐC 24h b) ĐC 48h c) ĐC 72h d) ĐC 96h
Hình 4.6. Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau khi nuôi cấy 24, 48, 72, 96 giờ
a) CPE 24h b) CPE 48h c) CPE 72h d) CPE 96h
Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK cho thấy bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sau 24 h gây nhiễm virus, tế bào bị phá hủy, co tròn, nổi lên. Đến 48h đa số tế bào CRFK đã bị phá hủy và nổi lên. Sau 72h trở đi, tế bào bị phá hủy gần như hoàn toàn (Hình 4.5 và 4.6). Để khẳng định sự thành công trong phân lập virus, tế bào gây nhiễm và không gây nhiễm virus đã được xác nhận bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện Parvovirus
(555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001). Kết quả phản ứng PCR đã thu được sản phẩm PCR có kích thước là 583 bp, đúng với kích thước đã công bố về cặp mồi này (kết quả không được thể hiện). Chủng virus phân lập thành công được đặt tên là L12.
4.4. KẾT CỦA XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ CỦA PARVOVIRUS TRÊN MÔI
TRƢỜNG TẾ BÀO
Để xác định nồng độ của chủng virus phân lập được, tế bào CRFK đã được sử dụng để chuẩn độ virus. Kết quả chuẩn độ để xác định hiệu giá Parvovirus trên môi trường tế bào được thể hiện trong bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định hiệu giá Parvovirus trên đĩa nuôi cấy tế bào 96
giếng sau 96 giờ gây nhiễm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + + + + + - - - - B + + + + + + - - - - C + + + + + - - - - D + + + + + - - - - E + + + + + + - - - - F + + + + + - - - - G + + + + + + - - - - H + + + + + + - - - -
Chú thích: – Giếng không có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bám đáy phát triển bình thường. + Giếng có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bị phá hủy hoàn toàn.
Kết quả chuẩn độ virus cho thấy 10-6 là độ pha loãng virus lớn nhất ở đó vẫn quan sát được bệnh tích. Ở các độ pha loãng 10-7 đến 10-10 đều không quan sát được bệnh tích. Theo công thức tính Spearman – Karber, chủng L12 được xác định có hiệu giá 106.13
TCID50/1 ml.
Log10TCID50/ml = 6.13
4.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐƢỜNG CONG SINH TRƢỞNG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để theo dõi quá trình phát triển, nhân lên theo thời gian và thời điểm đạt hiệu giá cao nhất của Parvovirus đã phân lập được, trong nghiên cứu này thí nghiệm xác định đường cong sinh trưởng của chủng virus L12 đã được thiết lập. Quá trình xác định đường cong sinh trưởng được thực hiện như sau:
Tiến hành gây nhiễm virus với nồng độ là 0,69 × 106.13/ml lên tế bào ở 8 chai T25 với cùng một liều 0.5 ml/chai và 1 chai làm đối chứng âm không gây nhiễm virus. Cả 7 chai sau đó đều được nuôi ở cùng điều kiện 37ºC và 5% CO2. Virus được thu ở các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm. Sau 96h, tất cả các chai gây nhiễm được tiến hành đông tan 3 lần và thu virus. Hàm lượng virus ở các thời điểm khác nhau được xác định bằng phương pháp chuẩn độ TCID50.
4.5.1. Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus
Sau quá trình gây nhiễm virus, bệnh tích tế bào CPE được quan sát ở từng thời điểm thu virus. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm được thể hiện ở bảng 4.6:
Bảng 4.6. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus
Thời điểm 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
Bệnh tích tế bào - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++
Chú thích: (-) tế bào chưa xuất hiện bệnh tích; (+) tế bào xuất hiện bệnh tích khoảng 10%; (++) tế bào có bệnh tích khoảng 50%; (+++) tế bào có bệnh tích khoảng 70%;
ĐC tế bào 12h ĐC tế bào 24h ĐC tế bào 36h ĐC tế bào 48h ĐC tế bào 72h ĐC tế bào 96h
CPE 12h CPE 24h CPE 36h CPE 48h CPE 72h CPE 96h
Hình 4.8. Hình ảnh bệnh tích tế bào và đối chứng âm của Parvovirus gây nhiễm trên tế bào CRFK
Kết quả quan sát CPE tại các thời điểm thu virus cho thấy sau 12h bệnh tích tế bào chưa xuất hiện; sau 24h quan sát được trên kính hiển vi soi ngược (khoảng 10%), số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 36h gây nhiễm đạt khoảng 50%, đạt xấp xỉ 70% ở thời điểm 48h sau gây nhiễm. CPE đạt 100% được ghi nhận tại thời điểm 60h sau gây nhiễm virus L12 cho đến khi thu virus tại thời điểm 96h.
Bảng 4.7. Kết quả chuẩn độ TCID50 của các chai gây nhiễm thu hoạch ở các thời điểm khác nhau
Thời điểm thu virus Log10TCID50/ml
12h 1.25 24h 2.50 36h 3.50 48h 5.50 60h 5.75 72h 6.00 84h 5.00 96h 4.00
4.5.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau
Để xác định thời điểm thu được nồng độ virus cao nhất, thí nghiệm đo hiệu giá tại mỗi thời điểm thu virus được tiến hành.
Kết quả chuẩn độ tính theo công thức Spearman – Kaber được tổng hợp như bảng sau:
Sau khi gây nhiễm Parvovirus lên trên tế bào CRFK từ 12 đến 72 giờ , hiệu giá virus tăng dần từ 1.25 Log10TCID50 đến 6.00 Log10TCID50. Sau 72 giờ, hiệu giá của virus giảm dần cho đến khi thu virus tại thời điểm 96 giờ hiệu giá virus còn là 4.00 Log10TCID50.
4.5.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của virus
Tổng hợp kết quả chuẩn độ hiệu giá virus, đường cong sinh trưởng được xây dựng có biến là Log10 của TCID50 tại từng thời điểm thu virus được thể hiện bằng biểu đồ sau:
Hình 4.9. Biểu đồ đường cong sinh trưởng của Parvovirus trên tế bào CRFK
Biểu đồ trên cho thấy chủng L12 có hiệu giá tăng dần theo thời gian, ổn định từ khoảng 48h đến 72h sau gây nhiễm. Hiệu giá đạt cực đại (106
TCID50/ml) tại thời điểm 72h sau khi gây nhiễm. Từ sau 72h trở đi, khi tế bào đã bị phá hủy nhiều hơn, nồng độ virus giảm xuống nhanh chóng, tới 96h sau gây nhiễm, hiệu giá virus đã giảm xuống khoảng 1.5 log so với cực đại. Như vậy, thời gian virus phát triển nhanh nhất là từ 48h đến 72h, sau 72h nồng độ của virus có xu hướng giảm dần.
Từ đó, có thể xác định được thời điểm thu virus thích hợp để virus đạt hiệu giá cao nhất. Kết quả phân tích đường cong sinh trưởng của chủng virus L12 cho thấy virus đạt hiệu giá cao nhất trong giai đoạn 60h đến 72h sau gây nhiễm.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
1) Kết quả chẩn đoán Parvovirus bằng phương pháp PCR cho thấy 22/24 (92%) mẫu phân tiêu chảy từ chó nghi mắc Parvovirus cho kết quả dương tính. 2) Kết quả phân tích trình tự gen VP2 cho thấy 4 chủng virus trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng về nt và aa với nhau là 99 - 99,6% (nt) và 97,1 - 98,8% (aa). Trong đó 2 chủng L04 và chủng L12 có mức độ tương đồng cao về nt và aa với nhau tương ứng là 99,6% và 98,8% . Kết quả phân tích về trình tự nt và aa suy diễn của đoạn gen VP2 cho thấy chủng L04 có 7 aa sai khác với 3 chủng L05, L12, L14. Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) và 430 (LS).
3) Kết quả phân tích so sánh về trình tự nt của 4 chủng Parvovirus cho thấy 4 chủng Parvovirus của Lào có mức độ tương đồng từ 97,3 - 97,7% nt và 94,2 - 95,4% aa khi so sánh vơi chủng vaccine của Hàn Quốc. Trong đó chủng L04 và L12 có tỷ lệ tương đồng về trình tự nt và aa cao hơn khi so với chủng virus vaccine, tỷ lệ tương đồng là 97,7% nt và 95,4% aa. Ngược lại 2 chủng L05 và L14 có tỷ lệ tương đồng thấp hơn lần lượt là 97,3 - 97,5% nt và 94,2 - 94,8% aa. 4) Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự nt gen VP2 của các chủng Parvovirus cho thấy 4 chủng L04, L05, L12, L14 đều nằm trên cùng 1 nhánh phát sinh với các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó có mối quan hệ gần gữi với các chủng nằm trên Genotype 2c của Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) và chủng của Việt Nam (Genbank: LC214969).
5) Đã phân lập thành công parvovirus trên môi trường tế bào CRFK. 6) Chủng virus phân lập được có hiệu giá 106.13 TCID50/ml.
5.2. KIẾN NGHỊ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1. Tiếp tục thu thập các chó mắc Parvovirus trên các giống chó khác để có thể phân lập được nhiều mẫu Parvovirus phục vụ cho việc sàng lọc và lựa chọn chủng virus từ thực địa.
2. Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá về sự ổn định đặc tính sinh học của chủng Parvovirus phân lập được trên môi trường nuôi cấy qua nhiều đời và đánh giá độc lực trên chó thí nghiệm.
3. Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự toàn bộ genome của 4 chủng
Parvovirus phân lập được nhằm xác định được sự khác nhau về dữ liệu di truyền
giữa các chủng virus nghiên cứu.
4. Nghiên cứu lựa chọn chủng vaccine Parvovirus thích hợp cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chẩn đoán cũng như chế tạo Kit chẩn đoán nhanh chó mắc Parvovirus.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Bích, T. N., Thảo, T. T., Việt, N. Q., và Mai, N. T. Y. (2013). KHẢO SÁT TỶ LỆ BỆNH DO PARVOVIRUS TRÊN CHÓ TỪ 1 ĐẾN 6 THÁNG TUỔI Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. tr. 15-20.
2. Du, T., và Giao, X. (2006). Kỹ thuật nuôi chó, mèo và phòng trị bệnh thường gặp. NXB lao động xã hội, Hà Nội. Tr. 69 -72.
3. Nguyễn Như Pho (2003). Bệnh Parvovirus và Care trên chó." NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Văn Thanh, Vũ Như Quán, Sử Thanh Long và Nguyễn Đức Trường (2016). Bệnh của chó ở Việt Nam và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Phạm Sỹ Lăng và cs. (2006). Kỹ thuật nuôi chó và phòng chống bệnh cho chó." NXB Lao động xã hội, Hà Nội.
6. Phan, T. K. N., và Trần, T. N. T. (2002). Thực hiện tiêu bản về sự sinh sản của tế bào thực vật: Ủy ban nhân dân tỉnh an Giang. Trường đại học An Giang.
7. Trần Thanh Phong và Nguyễn Thị Thơ. (1996). Một số bệnh truyền nhiễm chính trên chó.
8. Vương Đức Chất và Lê Thị Tài. (2004). Bệnh thường gặp ở chó mèo và cách phòng trị. NXB Nông nghiệp Hà Nội. ( ed.)
II. Tài liệu tiếng Anh:
9. Allen, R., Pereira, L., Raes, D., and Smith, M. (1998). Guidelines for computing crop water requirements-FAO Irrigation and drainage paper 56; FAO-Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome (http://www. fao. org/docrep). ARPAV (2000), La caratterizzazione climatica della Regione Veneto, Quaderni per. Geophysics. pp. 156, 178.
10. Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli, A., Buonavoglia and Carmichael, L. (2001). Evidence for evolution of canine parvovirus type 2 in Italy. Journal of General Virology. 82(12). pp. 3021-3025.
11. Buonavoglia, D., Cavalli, A., Pratelli, A., Martella, V., Greco, G., Tempesta, M., and Buonavoglia, C. (2000). Antigenic analysis of canine parvovirus strains isolated in Italy. The new microbiologica. 23(1). pp. 93-96.
12. Burtonboy, G., Coignoul, F., Delferriere, N. and Pastoret, P.-P. (1979). Canine hemorrhagic enteritis: detection of viral particles by electron microscopy. Archives of virology. 61(1-2). pp. 1-11.
13. Butler, J. (2004). Undoing gender: routledge.
14. Carmichael, L., and Binn, L. (1981). New enteric viruses in the dog. Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine (USA).
15. Carmichael, L., Joubert, J., and Pollock, R. (1980). Hemagglutination by canine parvovirus: serologic studies and diagnostic applications. American journal of veterinary research. 41(5). pp. 784-791.
16. Decaro, N., Desario, C., Addie, D. D., Martella, V., Vieira, M. J., Elia and G. Thiry, E. (2007). Molecular epidemiology of canine parvovirus, Europe. Emerging infectious diseases. 13(8). pp. 1222.
17. Decaro, N., Elia, G., Martella, V., Campolo, M., Desario, C., Camero and Narcisi, D. (2006). Characterisation of the canine parvovirus type 2 variants using minor groove binder probe technology. Journal of virological methods. 133(1). pp. 92-99.
18. Hong, C., Decaro, N., Desario, C., Tanner, P., Pardo, M. C., Sanchez and Saliki, J. T. (2007). Occurrence of canine parvovirus type 2c in the United States. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 19(5). pp. 535-539.
19. Johnson, R. and Spradbrow, P. (1979). Isolation from dogs with severe enteritis of a parvovirus related to feline panleucopaenia virus. Australian Veterinary Journal. 55. (3) . pp. 151-152.
20. Kelly, W. (1978). An enteric disease of dogs resembling feline panleucopaenia. Australian Veterinary Journal. 54 (12).pp. 593-593.
21. Lin, C.-N., Chien, C.-H., Chiou, M.-T., Chueh, L.-L., Hung, M.-Y and Hsu, H.-S. (2014). Genetic characterization of type 2a canine parvoviruses from Taiwan reveals the emergence of an Ile324 mutation in VP2. Virology journal. 11(1).pp. 39.
22. Martella, V., Cavalli, A., Pratelli, A., Bozzo, G., Camero, M., Buonavoglia and Buonavoglia, C. (2004). A canine parvovirus mutant is spreading in Italy. Journal of Clinical Microbiology. 42 (3). pp. 1333-1336. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
23. Martella, V., Decaro and Buonavoglia, C. (2006). Evolution of CPV-2 and implicance for antigenic/genetic characterization. Virus genes. 33(1). pp. 11-13. 24. Mochizuki, M., Harasawa, R., and Nakatani, H. (1993). Antigenic and genomic
variabilities among recently prevalent parvoviruses of canine and feline origin in Japan. Veterinary microbiology. 38(1-2). pp. 1-10.
25. Moraillon, R. (1993). Les vomissements des carnivores. Orientaton diagnostique et conduite a tenir. Recueil de Medecine Veterinaire. 169. pp. 963-967.
26. Nakamura, M., Tohya, Y., Miyazawa and Mochizuki (2004). A novel antigenic variant of canine parvovirus from a Vietnamese dog. Archives of virology. 149(11).pp. 2261-2269.
27. Ohshima, T., Hisaka, M., Kawakami, K., Kishi, M., Tohya and Mochizuki, M. (2008). Chronological analysis of canine parvovirus type 2 isolates in Japan. Journal of Veterinary Medical Science. 70(8). pp. 769-775.
28. Parrish, C. R. (1991). Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleukopenia virus using infectious plasmid clones.