Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2.Kết quả xây dựng cây phả hệ (Phylogenetic Tree)
4.2.1. Kết quả phân tích sự tƣơng đồng của Nuclotide của các chủng
Parvovirus đã nghiên cứu
Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên chó do Parvovirus phân bố khắp thế giới và bệnh nghiêm trọng với đối tượng chó con. Parvovirus có 3 genotype (2a, 2b và 2c) được phân biệt dựa vào sự khác nhau một số aa trên trình tự của đoạn gen VP2 (Martella et al.,2006). Đoạn gen VP2 mã hoá cho protein capsid của virus, đó là protein có vai trò chính trong cấu trúc của CPV2 và quyết định đến tính gây bệnh trên vật chủ. Vì vậy, một sự thay đổi nhỏ thành phần aa trong VP2 sẽ ảnh hưởng đến thay đổi đặc tính gây bệnh của Parvovirus (Lin et al., 2014). Vì vậy, nghiên cứu về sự thay đổi trên đoạn gen VP2 là mối quan tâm lớn liên quan đến nghiên cứu vaccine và đặc tính di truyền của Parvovirus. Kết quả nghiên cứu cho thấy 22 chó dương tính với Parvovirus, tuy nhiên, do điều kiện kinh tế và thời gian không cho phép nên chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đại diện ngẫu nhiên 4 mẫu bệnh phẩm dương tính với parvovirus để tiến hành giải trình tự gen, các mẫu bệnh phẩm được ký hiệu như sau: L04, L05, L12, L14.
Kết quả giải trình tự một phần gen VP2 của 4 chủng parvovirus trong nghiên cứu đã thu được trình tự nt với độ dài 583 bp. Để so sánh về mức độ tương đồng về trình tự nt của 4 chủng Parvovirus trong nghiên cứu này với các chủng Parvovirus tham chiếu khác trên thế giới, 1 chủng vaccine là chủng CPVpf (vaccine) của Korea (GenBank: FJ197847) và 17 chủng Parvovirus phân lập được từ thực địa khác nhau trên thế giới cũng đã được sử dụng, bao gồm 3 chủng của Lào (GenBank: KX601674, KX601678, KX601682), 7 chủng của Trung Quốc (GenBank: KR611522, KT156832, KT162005, KY937650, MF347723, MF347725, MN119604), 3 chủng của Viêt Nam (GenBank: AB120727, LC214969, LC214970), 1 chủng của Đài Loan (GenBank: KU744254), 1 chủng của Ý (GenBank: FJ222821), 1 chủng của Đức (GenBank: FJ005203), và 1
Hinh 4.2. Sự tƣơng đồng về nucleotide giữa các chủng Parvovirus nghiên cứu
với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới
Bảng 4.3. Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về trình tự nt của các chủng Parvovirus trong nghiên cứu này
với nhau và với các chủng Parvovirus tham chiếu khác.
Tên chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 FJ197847/Korea/Vaccnine/2007 ID KX601674/Laos/2c/2016 90.4 ID KX601682/Laos/2c/2016 90.6 99.1 ID KR611522/China/2c/2014 97.9 92.5 92.7 ID KX601678/Laos/2c/2016 90.8 98.9 99.7 92.5 ID KT156832/China/2c/2014 97.9 92.5 92.7 100 92.5 ID KT162005/China/2c/2014 97.9 92.5 92.7 100 92.5 100 ID KY937650/China/2c/2016 98 92.3 92.5 99.8 92.3 99.8 99.8 ID KU744254/Taiwan/2c/2015 97.5 92.1 92.3 99.6 92.1 99.6 99.6 99.4 ID FJ222821/Italy/2c/2000 98.6 91.8 92 99.2 92.1 99.2 99.2 99.4 98.8 ID AB120727/Vietnam/2b/2004 98.2 91.4 91.6 98.8 91.8 98.8 98.8 99 98.4 99.6 ID FJ005203/Germany/2c/1998 98.6 91.8 92 99.2 92.1 99.2 99.2 99.4 98.8 100 99.6 ID GQ865518/Greece/2c/2008 98.6 91.8 92 99.2 92.1 99.2 99.2 99.4 98.8 100 99.6 100 ID LC214970/Vietnam/2a/2013 98.2 91.6 91.8 98.8 92 98.8 98.8 99 98.4 98.8 98.4 98.8 98.8 ID LC214969/Vietnam/2c/2013 97.9 92.5 92.7 100 92.5 100 100 99.8 99.6 99.2 98.8 99.2 99.2 98.8 ID MF347723/China/2c/2016 97.7 92.3 92.5 99.8 92.3 99.8 99.8 99.6 99.4 99 98.6 99 99 98.6 99.8 ID MN119604/China/2c/2019 97.9 92.5 92.7 100 92.5 100 100 99.8 99.6 99.2 98.8 99.2 99.2 98.8 100 99.8 ID MF347725/China/2c/2017 97.9 92.5 92.7 100 92.5 100 100 99.8 99.6 99.2 98.8 99.2 99.2 98.8 100 99.8 100 ID L04/2019 97.7 92.3 92.5 99.8 92.3 99.8 99.8 99.6 99.4 99 98.6 99 99 98.6 99.8 99.6 99.8 99.8 ID L05/2019 97.3 92 92.1 99.4 92 99.4 99.4 99.2 99 98.6 98.2 98.6 98.6 98.2 99.4 99.6 99.4 99.4 99.2 ID L12/2019 97.7 92.3 92.5 99.8 92.3 99.8 99.8 99.6 99.4 99 98.6 99 99 98.6 99.8 99.6 99.8 99.8 99.6 99.2 ID L14/2019 97.5 92.1 92.3 99.6 92.1 99.6 99.6 99.4 99.2 98.8 98.4 98.8 98.8 98.4 99.6 99.4 99.6 99.6 99.4 99 99.4 ID
Kết quả phân tích trình tự gen cho thấy 4 chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng về nt với nhau là 99 - 99,6%. Trong đó 2 chủng L04 và chủng L12 có mức độ tương đồng về nt với nhau là 99,6% (Bảng 4.3). Kết quả phân tích về trình tự nt của đoạn gen cho thấy chủng L04 có 7 nt sai khác với 3 chủng L05, L12, L14. Các vị trí nt sai khác gồm vị trí 954 (AT), 959 (GC), 964 (AG), 1139 (TC), 1240 (CT), 1286 (TG) và 1289 (TC) (Hình 4.2).
Kết quả phân tích so sánh về trình tự nt của 4 chủng Parvovirus cho thấy 4 chủng Parvovirus của Lào có mức độ tương đồng từ 97,3 - 97,7% khi so sánh với chủng vaccine của Hàn Quốc. Trong đó chủng L04 và L12 có tỷ lệ tương đồng về trình tự nt cao hơn so với chủng virus vaccine, tỷ lệ tương đồng là 97,7% nt. Ngược lại 2 chủng L05 và L14 có tỷ lệ tương đồng thấp hơn lần lượt là 97,3 - 97,5% nt (Bảng 4.3).
4.2.2. Kết quả phân tích sự tƣơng đồng của Amino acid của các chủng
Parvovirus đã nghiên cứu.
Từ kết quả giải trình tự gen của 4 chủng virus đã nghiên cứu, thu được trình tự aa của chủng Parvovirus với độ dài 174 bp. Trong nghiên cứu này trình tự amino acid suy diễn được mã hóa bởi gen VP2 của 4 chủng
parvovirus của Lào cũng đã được phân tích và so sánh với các chủng tham
Hinh 4.3 Sự tƣơng đồng về amino acid giữa các chủng Parvovirus nghiên
cứu với một số chủng virus Parvovirus trên thế giới
Bảng 4.4. Tỷ lệ (%) tƣơng đồng về trình tự aa của các chủng Parvovirus trong nghiên cứu này với nhau
và với các chủng Parvovirus tham chiếu khác.
Tên chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 FJ197847/Korea/Vaccnine/2007 ID KX601674/Laos/2c/2016 88.5 ID KX601682/Laos/2c/2016 88 98.7 ID KR611522/China/2c/2014 96 92.5 92 ID KX601678/Laos/2c/2016 88 98.7 100 92 ID KT156832/China/2c/2014 96 92.5 92 100 92 ID KT162005/China/2c/2014 96 92.5 92 100 92 100 ID KY937650/China/2c/2016 96.5 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 ID KU744254/Taiwan/2c/2015 94.8 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 98.2 ID FJ222821/Italy/2c/2000 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 ID AB120727/Vietnam/2b/2004 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 ID FJ005203/Germany/2c/1998 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 100 ID GQ865518/Greece/2c/2008 97.1 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 99.4 97.7 100 100 100 ID LC214970/Vietnam/2a/2013 96.5 90.8 90.2 98.2 90.2 98.2 98.2 98.8 97.1 98.2 98.2 98.2 98.2 ID LC214969/Vietnam/2c/2013 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 ID MF347723/China/2c/2016 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 ID MN119604/China/2c/2019 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 100 99.4 ID MF347725/China/2c/2017 96 92.5 92 100 92 100 100 99.4 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.2 100 99.4 100 ID L04/2019 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 98.8 99.4 99.4 ID L05/2019 94.2 90.8 90.2 98.2 90.2 98.2 98.2 97.7 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 96.5 98.2 98.8 98.2 98.2 97.7 ID L12/2019 95.4 92 91.4 99.4 91.4 99.4 99.4 98.8 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 97.7 99.4 98.8 99.4 99.4 98.8 97.7 ID L14/2019 94.8 91.4 90.8 98.8 90.8 98.8 98.8 98.2 97.7 97.7 97.7 97.7 97.7 97.1 98.8 98.2 98.8 98.8 98.2 97.1 98.2% ID
Kết quả phân tích trình tự gen cho thấy 4 chủng virus nghiên cứu có mức độ tương đồng về aa với nhau là 97,1 - 98,8%. Trong đó 2 chủng L04 và chủng L12 có mức độ tương đồng về aa với nhau là 98,8% (Bảng 4.4). Kết quả phân tích về trình tự aa suy diễn của đoạn gen cho thấy chủng L04 có 7 aa sai khác với 3 chủng L05, L12, L14. Các vị trí aa sai khác gồm vị trí 318 (CH), 320 (GA), 322 (TA), 380 (FS), 414 (RW), 429 (VG) và 430 (LS) (Hình 4.3).
Kết quả phân tích so sánh về trình tự aa của 4 chủng Parvovirus cho thấy 4 chủng Parvovirus của Lào có mức độ tương đồng từ 94,2 - 95,4% khi so sánh với chủng vaccine của Hàn Quốc. Trong đó chủng L04 và L12 có tỷ lệ tương đồng về trình tự aa cao hơn so với chủng virus vaccine, tỷ lệ tương đồng là 95,4% aa. Ngược lại 2 chủng L05 và L14 có tỷ lệ tương đồng thấp hơn lần lượt là 94,2 - 94,8% aa (Bảng 4.4).
4.2.3. Kết quả xây dựng cây phả hệ
Hình 4.4. Cây phả hệ của các chủng Parvovirus nghiên cứu dựa trên trình tự
Sau khi so sánh mức độ tương đồng về nt và aa giữa những chủng
Parvovirus trong nghiên cứu, dựa vào phần mềm MEGA7 chúng tôi đã tiến hành
xây dựng cây sinh học phân tử để xác định và phân tích nguồn gốc phát sinh của các chủng virus trong nghiên cứu với các chủng Parvovirus tham chiếu khác được lấy từ ngân hàng GenBank.
Kết quả xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nt của gen VP2 của các chủng Parvovirus cho thấy 4 chủng L04, L05, L12, L14 trong nghiên cứu này đều nằm trên cùng 1 nhánh phát sinh với các chủng Parvovirus gây bệnh trên chó có mối quan hệ gần gũi với các chủng nằm trên Genotype 2c của Trung Quốc (GenBank: MF347723, KT156832, MF347725) và chủng của Việt Nam (Genbank: LC214969) (Hình 4.4).
Dựa trên kết quả phân tích mức độ tương đồng nt, aa và kết quả phân tích cây phả hệ cho thấy cả 4 chủng Parvovirus trong nghiên cứu này L04, L05, L12 và L14 đều thuộc Genotype 2c.
4.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CHỦNG PARVOVIRUS TRÊN MÔI TRƢỜNG
NUÔI CẤY TẾ BÀO CRFK (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.3.1. Kết quả nuôi cấy tế bào CRFK
Tế bào CRFK được phục hồi và thực hiện cấy chuyển xác định mật độ tế bào thích hợp để gây nhiễm với môi trường nuôi cấy DMEM có bổ sung 5% FBS. Một ống giống tế bào CRFK chứa 5x106
tế bào, được lấy ra từ bình Nitơ lỏng nuôi cấy trong một chai T25. Trong quá trình nuôi, mật độ tế bào được ghi chép ở các thời điểm khác nhau. Kết quả quan sát cho thấy tế bào sau 12h bắt đầu bám đáy, sau 24h tế bào vươn dài ra bám vào bề mặt chai. Tế bào có hình dạng thuôn dài, vươn phủ khoảng 80% bề mặt chai sau 48h, và sau 72h tế bào phủ kín, bắt đầu có dấu hiệu già, tế bào chết co tròn và nổi lên.
a) Tế bào 24h b) Tế bào 48h c) Tế bào 72h d) Tế bào 96h
4.3.2. Kết quả phân lập Parvovirus
Kết quả phân tích về phả hệ cho thấy các chủng parvovirus trong nghiên cứu này có sự tương đồng rất cao (gần 100%) về trình tự nt và aa, cùng thuộc Genotype 2c. Ngoài các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, trong nghiên cứu này chủng
parvovirus cũng đã được phân lập thành công trên môi trường tế bào CRFK.
a) ĐC 24h b) ĐC 48h c) ĐC 72h d) ĐC 96h
Hình 4.6. Hình ảnh đối chứng tế bào CRFK không gây nhiễm virus sau khi nuôi cấy 24, 48, 72, 96 giờ
a) CPE 24h b) CPE 48h c) CPE 72h d) CPE 96h
Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào CRFK cho thấy bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sau 24 h gây nhiễm virus, tế bào bị phá hủy, co tròn, nổi lên. Đến 48h đa số tế bào CRFK đã bị phá hủy và nổi lên. Sau 72h trở đi, tế bào bị phá hủy gần như hoàn toàn (Hình 4.5 và 4.6). Để khẳng định sự thành công trong phân lập virus, tế bào gây nhiễm và không gây nhiễm virus đã được xác nhận bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện Parvovirus
(555forc/555revc) (Canio Buonavoglia et al.,2001). Kết quả phản ứng PCR đã thu được sản phẩm PCR có kích thước là 583 bp, đúng với kích thước đã công bố về cặp mồi này (kết quả không được thể hiện). Chủng virus phân lập thành công được đặt tên là L12.
4.4. KẾT CỦA XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ CỦA PARVOVIRUS TRÊN MÔI
TRƢỜNG TẾ BÀO
Để xác định nồng độ của chủng virus phân lập được, tế bào CRFK đã được sử dụng để chuẩn độ virus. Kết quả chuẩn độ để xác định hiệu giá Parvovirus trên môi trường tế bào được thể hiện trong bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định hiệu giá Parvovirus trên đĩa nuôi cấy tế bào 96
giếng sau 96 giờ gây nhiễm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A + + + + + + - - - - B + + + + + + - - - - C + + + + + - - - - D + + + + + - - - - E + + + + + + - - - - F + + + + + - - - - G + + + + + + - - - - H + + + + + + - - - -
Chú thích: – Giếng không có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bám đáy phát triển bình thường. + Giếng có bệnh tích tế bào (CPE), tế bào bị phá hủy hoàn toàn.
Kết quả chuẩn độ virus cho thấy 10-6 là độ pha loãng virus lớn nhất ở đó vẫn quan sát được bệnh tích. Ở các độ pha loãng 10-7 đến 10-10 đều không quan sát được bệnh tích. Theo công thức tính Spearman – Karber, chủng L12 được xác định có hiệu giá 106.13
TCID50/1 ml.
Log10TCID50/ml = 6.13
4.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐƢỜNG CONG SINH TRƢỞNG
Để theo dõi quá trình phát triển, nhân lên theo thời gian và thời điểm đạt hiệu giá cao nhất của Parvovirus đã phân lập được, trong nghiên cứu này thí nghiệm xác định đường cong sinh trưởng của chủng virus L12 đã được thiết lập. Quá trình xác định đường cong sinh trưởng được thực hiện như sau:
Tiến hành gây nhiễm virus với nồng độ là 0,69 × 106.13/ml lên tế bào ở 8 chai T25 với cùng một liều 0.5 ml/chai và 1 chai làm đối chứng âm không gây nhiễm virus. Cả 7 chai sau đó đều được nuôi ở cùng điều kiện 37ºC và 5% CO2. Virus được thu ở các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm. Sau 96h, tất cả các chai gây nhiễm được tiến hành đông tan 3 lần và thu virus. Hàm lượng virus ở các thời điểm khác nhau được xác định bằng phương pháp chuẩn độ TCID50.
4.5.1. Kết quả bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus
Sau quá trình gây nhiễm virus, bệnh tích tế bào CPE được quan sát ở từng thời điểm thu virus. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm được thể hiện ở bảng 4.6:
Bảng 4.6. Bệnh tích tế bào tại các thời điểm thu virus
Thời điểm 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
Bệnh tích tế bào - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích: (-) tế bào chưa xuất hiện bệnh tích; (+) tế bào xuất hiện bệnh tích khoảng 10%; (++) tế bào có bệnh tích khoảng 50%; (+++) tế bào có bệnh tích khoảng 70%;
ĐC tế bào 12h ĐC tế bào 24h ĐC tế bào 36h ĐC tế bào 48h ĐC tế bào 72h ĐC tế bào 96h
CPE 12h CPE 24h CPE 36h CPE 48h CPE 72h CPE 96h
Hình 4.8. Hình ảnh bệnh tích tế bào và đối chứng âm của Parvovirus gây nhiễm trên tế bào CRFK
Kết quả quan sát CPE tại các thời điểm thu virus cho thấy sau 12h bệnh tích tế bào chưa xuất hiện; sau 24h quan sát được trên kính hiển vi soi ngược (khoảng 10%), số lượng tế bào bị phá hủy tăng dần sau 36h gây nhiễm đạt khoảng 50%, đạt xấp xỉ 70% ở thời điểm 48h sau gây nhiễm. CPE đạt 100% được ghi nhận tại thời điểm 60h sau gây nhiễm virus L12 cho đến khi thu virus tại thời điểm 96h.
Bảng 4.7. Kết quả chuẩn độ TCID50 của các chai gây nhiễm thu hoạch ở các thời điểm khác nhau
Thời điểm thu virus Log10TCID50/ml
12h 1.25 24h 2.50 36h 3.50 48h 5.50 60h 5.75 72h 6.00 84h 5.00 96h 4.00
4.5.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virus ở từng thời điểm thu hoạch khác nhau
Để xác định thời điểm thu được nồng độ virus cao nhất, thí nghiệm đo