Nghiên vật liệu

Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu

3.4.Nghiên vật liệu

3.4.1. Hóa chất

 Kit PCR – (iNtRON- 2x PCR Master mix solution- i-Taq)

 Agarose – Invitrogen

 Đệm chạy điện di 1X TBE

 Hóa chất nhuộm gel (iNtRON- Redsafe)

 DNA Ladder – Thermo

 Hóa chất dùng cho nuôi cấy phân lập virus:

 Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) – Gibco

 FBS (Fetal Bovine Serum) – Sigma

 1X Trypsin – Gibco

 Kháng sinh gentamycin 1X PBS

3.4.2. Trang thiết bị máy móc

 Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Biohazard safety Cabinet)

 Pipette chính xác 10µl, 20µl, 200µ, 1000µl.

 Đầu côn tương ứng 10µl, 200µl, 1000µl.

 Eppendorf tube 1,5ml, 200µ, ống ly tâm 15ml.

 Khay đựng ống Eppendorf, găng tay, bông cồn, cân…

 Nồi hấp nhiệt tiệt trùng

 Các loại tủ lạnh 40C, -200C, -300C, -800C.

 Máy chạy PCR: Sytem 9700 (GeneAmp).

 Máy ly tâm bản Eppendorf (Refrigerated Microcentrifuge).

 Máy ly tâm lạnh Centrifuge.

 Máy vontex LaborA (Bioblock Scientific).

 Các loại máy móc, vật liệu thông thường phòng thí nghiệm.

 Găng tay, khẩu trang, bông cồn…

3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣờng pháp lấy mẫu

Dựa vào triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính bằng kít test nhanh chúng tôi thực hiện lấy mẫu như sau:

Dùng pipette nhựa thu mẫu phân trực tiếp trên khay của chuồng nuôi, cho vào ống falcon 15ml, sau đó đem bảo quản trong tử -20ᵒC.

3.5.2. Phƣơng pháp tách DNA tổng số

Mẫu phân sau khi thu được đã được xử lý và bảo quản trong tủ -20ᵒC đến khi tiến hành thí nghiệm.

Vật liệu di truyền của Parvovirus là DNA, để tiến hành nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử, chủng virus cần được tiến hành tách chiết DNA tổng số. Kit Genomic DNA Mini Kit Blood/ Cultured Cell được sử dụng để tách chiết DNA. Cụ thể: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Bổ sung 900 µl dung dịch RBC Lysis Buffer vào 300 µl mẫu bệnh phẩm, lắc đều, để nhiệt độ phòng 10 phút, đem ly tâm 3000g trong 5 phút sau khi ly tâm, loại bỏ dịch nổi và cho thêm 100 µl dung dịch RBC Lysis Buffer, dùng Pipet hút lên xuống cho đồng đều.

Bổ sung tiếp 200 µl dung dịch GB Buffer, lắc mạnh, ủ ở nhiệt độ 60 ºC trong 10 phút ( cứ 3 phút đảo 1 lần ), để nhiệt độ phòng 5 phút. ( cùng thời gian đó ủ riêng 200 µl dung dịch Elution Buffer ở nhiệt độ 60 ºC ).

Bổ sung tiếp 200 µl dung dịch Absolute Etbanol, lắc mạnh, spindown, hút hết dung dịch sang cột lọc, đem ly tâm 14-16000g trong 5 phút, sau đó cuyển cột lọc sang ống mới ( bỏ ống cũ và dung dịch trong ống cũ ).

Bổ sung 400 µl dung dịch W1 Buffer vào ống có cột lọc, ly tâm 14- 16000g trong 1 phút, đổ dịch ra,

Bổ sung tiếp 100 µl dung dịch Elution Buffer ( đem ủ từ bước thứ 2 ), để yêu 3 phút, ly tâm 14-16000g trong 1 phút, sau đó bỏ cột lọc, đóng ống, vậy là ta đã thu được DNA .

3.5.3. Phƣơng pháp PCR

Sau khi đã có DNA, tiến hành phản ứng PCR Thành phần: Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần Số lƣợng (µl) DNA 3 Primer H-Forward 1 Primer H-Rev 1

2x PCR Master mix solution 10

Distilled water 5

Tổng 20µl

Thông tin cặp mồi được sử dụng:

Mix các thành phần lại với nhau, trộn đều sau đó đem đi chạy PCR với chu trình nhiệt độ như sau:

Bảng 3.3. Thông tin cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR (Canio Buonavoglia et al., 2001)

Tên mồi Trình tự mồi 5’-3’ Kích thƣớc

555for CAGGAAGATATCCAGAAGGA

583bp 555rev GGTGCTAGTTGATATGTAATAAACA

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR

Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian (phút) Chu kỳ

Biến tính 940C 5 1 Biến tính 940C 1 40 Gắn mồi 510C 1 Kéo dài 720C 1 Kéo dài 720C 10 1

3.5.4. Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm

Chuẩn bị thạch 1.2% Agarose: cân 1.2g agarose hòa trong 100ml 1X TBE. Đun nóng hỗn hợp khoảng 2 phút đến khi agarose tan hoàn toàn, hỗn hợp chuyển sang trong suốt, để nguội khoảng 45-50°C.

Thêm 10µl thuốc nhuộm Redsafe, lắc đều; đổ gel vào khuôn đã cắm lược, giữ tĩnh ở nhiệt độ phòng khoảng 25-30 phút tới khi gel đông, tháo lược ra

Đổ dung dịch đệm chạy điện di 1X TBE vào khoang điện di sao cho ngập bản gel.

Lấy 5µl sản phẩm PCR, tiến hành tra vào các giếng; tra 5µl marker vào giữa giếng theo thứ tự: đối chứng âm và đối chứng dương, mẫu chạy điện di ở 100V trong 25 phút.

Đọc kết quả điện di; chụp lại kết quả bằng máy chụp gel, in ảnh.

3.5.5. Phƣơng pháp giải trình tự gen

Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi gửi sản phẩm PCR tinh sạch cho công ty ở Malaysia để giải trình tự gen, công ty giải trình tự gen trực tiếp bằng phương pháp sanger.

Xác định trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger, Smith và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật. F. sanger đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kí sinh vi khuẩn E.coli (1977), là bộ gen đầu tiên được xác định trình tự. Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp. Nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP). Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphotphas nhưng lại không tiếp tục kết hợp được với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo. Như vậy khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzyme polymeraze. Kết quả sẽ cho một loạt các đoạn DNA được kết thúc một cách đặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotid và sẽ thu được các đoạn DNA có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide. Chạy điện di các đoạn ta có thể xác định được trình tự đoạn DNA

Các bước thực hiện

Bước 1: Biến tính DNA khuôn, điện di trên gel polyacrylamid (có bổ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

sung ure) thu các mạch đơn DNA.

Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA

Lấy 4 ống eppendorf cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống ( DNA khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ, enzyme DNA polymeraze và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch đệm thích hợp). Bổ sung vào mỗi ống tương ứng một lượng nhỏ (1%) một loại ddNTP nhất định (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP).

Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt.

Bước 4: Điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch đơn DNA

được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn.

Phương pháp giải trình tự gen do F. Sanger và cộng sự phát minh có độ chính xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động.

3.5.6. Phƣơng pháp mở giống tế bào CRFK

Làm ấm môi trường trong bể ổn nhiệt ở 37°C.

Lấy ống cất tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng (-196°C), giải đông nhanh trong bể ổn nhiệt 37°C trong 2 phút.

Chuẩn bị 5ml môi trường DMEM vào ống falcon 15ml, hút toàn bộ dịch tế bào từ ống cất tế bào vào ống falcon đã chuẩn bị, đảo đều hỗn dịch.

Ly tâm dịch tế bào ở 1000 vòng/phút trong 5 phút.

Loại bỏ dịch, thu cặn tế bào, thêm 5ml môi trường nuôi cấy DMEM chứa 5% FBS vào ống, dùng pipet điện hút lên xuống nhiều lần để các tế bào tách nhau ra; chuyển huyễn dịch tế bào vào chai nuôi cấy tế bào (chai T25); (với chai T75 cần 15-20ml môi trường nuôi cấy).

Tế bào nuôi trong tủ ấm 37°C, với 5% CO2 ; hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào.

3.5.7. Phƣơng pháp cấy chuyển tế bào CRFK

Quan sát tế bào bằng kính hiển vi soi ngược hàng ngày, đến khi tế bào phủ đáy khoảng 90% có thể tiến hành cấy chuyển tế bào như sau:

Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa bề mặt tế bào bằng 1X PBS (2 lần)

Thêm 500µl Trypsin với chai T25 ( với chai T75 cần 1-2ml Trypsin), láng đều bề mặt tế bào để tế bào co lại.

Đặt chai nuôi cấy vào tủ 37ᵒC ủ 3 phút cho tế bào co lại.

Loại bỏ Trypsin, soi thấy tế bào co lại, tiến hành vỗ mạnh chai cho tế bào bong hết ra khỏi bề mặt chai.

Thêm môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS đã làm ấm vào chai nuôi, trộn đều tế bào; huyển tế bào vào các chai nuôi cấy khác nhau.

3.5.8. Phƣơng pháp phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK

Mẫu bệnh phẩm sau khi kiểm tra bằng phương pháp PCR thấy dương tính với Parvovirus được lựa chọn để gây nhiễm tế bào. Mẫu trước khi gây nhiễm được lọc qua màng lọc vi khuẩn (0,45µm).

Quy trình phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK như sau:

Chuẩn bị 2 chai tế bào T25 đã phủ 70% bề mặt, 1 chai để gây nhiễm, 1 chai để làm đối chứng tế bào.

Với cả 2 chai: Hút bỏ môi trường, rửa bề mặt tế bào bằng 1X PBS.

Dùng pippet hút 500µl môi trường DMEM vào chai đối chứng, 500µl virus vào chai cần gây nhiễm (đối với chai T25); láng nhẹ dịch khắp bề mặt chai, ủ lắc nhẹ trong khoảng 1h, 37°C, 5% CO2.

Sau 1h, loại bỏ virus trong chai.

Thêm môi trường duy trì DMEM 2% FBS vào các chai; nuôi trong tủ ấm 37°C, 2% CO2.

Quan sát hàng ngày để theo dõi sự nhân lên của virus trên tế bào . Có hai tường hợp xảy ra: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Trường hợp 1: Tế bào được theo dõi hằng ngày, sau khoảng 48- 72 giờ nuôi cấy thấy xuất hiện các đám tế bào co cụm lại, bị phá hủy, nổi lên trên để lại các khoảng trống. Khi đó, virus đã được phân lập thành công.

Trường hợp 2: Tế bào kể từ khi gây nhiễm cho đến 72-96 giờ không thấy xuất hiện bệnh tích tế bào, tế bào phát triển bình thường sau đó già, chết

dịch để tiếp tục gây nhiễm đời thứ hai, thứ ba,... cho đến khi thấy xuất hiện bệnh tích tế bào trên chai tế bào.

3.5.9. Phƣơng pháp thu virus

Chai tế bào đã gây nhiễm virus được giữ ở tủ -80°C, đông tan 3 lần. Sau khi đông tan, thu dịch nuôi cấy vào ống falcon 15ml; đem ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 5 phút.

Thu lấy phần dịch nổi ở trên vào các ống eppendorf, loại bỏ cặn tế bào.

Bảo quản dịch thu được trong tủ -80°C, ghi rõ đầy đủ thông tin.

3.5.10. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào

Nguyên lý

Phương pháp này sử dụng Trypan blue phân biệt tế bào sống và tế bào chết. Màng tế bào có khả năng thấm chọn lọc các chất đi vào trong tế bào. Trypan blue là thuốc nhuộm màu xanh và gây độc cho tế bào nên nó chỉ đi qua màng sinh chất của tế bào chết do vậy khi nhuộm tế bào vào trypan blue thì tế bào sống sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, tế bào chết sẽ bắt màu của thuốc nhuộm và có màu xanh.

Quy trình

Sử dụng 1%Trypan blue pha trong 1X PBS (không chứa Ca2+, Mg2+).

Pha loãng 100l huyền phù tế bào với 100l trypan blue, trộn đều.

Dùng nước cất và 70% Ethanol lau sạch và làm khô buồng đếm Neubauer.

Nhỏ 10µl huyền phù tế bào đã được pha loãng lên thành buồng đếm, đặt 1 tấm lamen lên và ép lamen dính vào buồng đếm.

Đếm số tế bào sống trong 4 ô vuông lớn ở 4 góc và một trung tâm.

Tính toán số lượng tế bào sống: C = a ×m×1/5×104

Trong đó: C: nồng độ tế bào/ml

a: tổng số tế bào đếm được trong 5 ô vuông lớn m: độ pha loãng giữa mẫu và Trypan blue 1/5: giá trị trung bình tế bào ở mỗi ô vuông

3.5.11. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus

Trong nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus, định lượng virus xác định TCID50 có vai trò quan trọng trong việc xác định lượng virus cần dùng để gây nhiễm tại MOI thích hợp, và việc xác định quy luật nhân lên của virus trên môi trường tế bào bằng cách dựng đường cong sinh trưởng. Khi đó, Log10 TCID50 là biến số để xây dựng.

TCID50 là phương pháp xác định hiệu giá virus dựa trên điểm tới hạn (end point) cho biết liều virus tại đó gây hủy hoại 50% số tế bào gây nhiễm.

Khảo sát về TCID50 được ứng dụng phổ biến trong các nghiên cứu xác định hiệu giá của virus. Virus được pha loãng theo cơ số 10 sau đó mỗi nồng độ được gây nhiễm lặp lại 8 lần trên khay tế bào 96 giếng đã được chuẩn bị trước . Sau đó, căn cứ vào số lượng các giếng có bệnh tích do virus gây nên trên tế bào để tính toán TCID50.

Thông thường phương pháp tính hiệu giá virus sử dụng tế bào được chuẩn bị ra đĩa 96 giếng trước 24h, sao cho sự phát triển của tế bào đạt 70% để gây nhiễm. Các bước tiến hành chuẩn độ như sau:

Tế bào được đếm để chuẩn bị ra đĩa 96 giếng trong môi trường DMEM có bổ sung 5% FBS với nồng độ tế bào là 100 tế bào/µl. Sau đó hút 100 µl huyễn dịch tế bào vào mỗi giếng. Tế bào được nuôi cấy trong tủ ấm 37ᵒC, 5% CO2 trong 24h.

 Chuẩn bị dịch virus cần xác định hiệu giá:

Tiến hành pha loãng virus theo cơ số 10 (từ 10-1- 10-10). Chuẩn bị dãy pha loãng với 10 ống eppendoft mỗi ống chứa 900 µl môi trường bổ sung 2% FBS, 100µl dịch virus ban đầu (100) được tra vào ống eppendorf thứ nhất để được dịch có độ pha loãng virus 10-1. Hút 100µl dịch virus 10-1 sang ống eppendorf thứ hai để có được dịch có độ pha loãng virus 10-2, tương tự đến nồng độ 10-10

.

 Thực hiện TCID50:

Mỗi độ pha loãng dùng 8 giếng, thể tích dịch cuối của mỗi giếng là 100µl. Tra 100µl mẫu virus có độ pha loãng 10-1 vào cột thứ nhất. Sau đó, tiếp tục xử dụng các ống eppendolf đã pha loãng virus ở các nồng độ khác nhau thêm vào các giếng tương ứng, các giếng tại cột 11 và 12 giữ lại làm đối chứng tế bào nên chỉ thêm 100µl môi trường nuôi cấy tế bào. Bố trí thí nghiệm như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Bảng 3.5. Sơ đồ thí nghiệm xác định TCID50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC B 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC C 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC D 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC E 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC F 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC G 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC H 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 CC CC

CC: Cells control – Đối chứng tế bào

Sau 48-72h, sự có mặt của virus trong các giếng được xác định bằng cách quan sát CPE dưới kính hiển vi. Một giếng được coi là âm tính nếu ở độ pha loãng đó tế bào vẫn phát triển bình thường, không có bệnh tích tế bào (giống đối chứng tế bào). Nếu ở độ pha loãng đó xuất hiện bệnh tích trên tế bào, các tế bào co cụm lại với nhau, bong khỏi đáy giếng thì giếng đó được coi là dương tính. Kết quả được đọc và tính TCID50 theo phương pháp Spearman-Karber (Spearman, 1908; Karber, 1931).

LogTCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n) Trong đó:

Xo là Log của nghịch đảo nồng độ virus pha loãng cao nhất (Xo=10) d là Log khoảng cách pha loãng (d=1)

ri là số giếng âm tính (không xuất hiện CPE)

n là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi nồng độ pha loãng