Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10μm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào.
Tăng trưởng và phân chia chậm: thời gian tăng trưởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút. Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thường, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tuy vậy một số tế bào như tế bào ung thư có thể sinh trưởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ.
Tế bào động vật có thể được bảo quản trong Nitơ lỏng ở nhiệt độ -196oC, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy khi phục hồi.
Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trưởng để phân chia (Phan và Trần, 2002).
2.4.2. Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột. Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hòa tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22μm.
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:
Carbonhydrate: glucose (5-10mM) được dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cần cho tổng hợp acid nucleic. Có thể dùng fructose thay thế cho glucose. Glucose có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric và sinh ra CO2.
tổng hợp protein. Người ta thường dùng glutamine, tuy nhiên, ammoniac được thành lập từ chuyển hóa glutamine có thể ức chế sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy.
Muối cũng được dùng để làm cho môi trường nuôi cấy có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào.
Bicarbonate (NaHCO3) cũng được dùng để đóng vai trò như hệ thống đệm
trong sự kết hợp với 5-10% CO2 được cung cấp bởi tủ ủ. Điều này cho phép môi trường duy trì có pH từ 7,2-7,4.
Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tương đối thấp và được dùng để kích thích sinh trưởng. Lượng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công thức môi trường khác nhau. Điều này cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là khác nhau.
Huyết thanh: được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt giá đỡ và phát triển mạnh hơn. Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thường được sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, nhưng lại đắt tiền và hiếm. Nồng độ huyết thanh thường được dùng từ 5- 20%. Những dòng tế bào liên tục có xu hướng thích nghi với môi trường có nồng độ huyết thanh thấp. Xu hướng hiện nay là sử dụng môi trường không huyết thanh nhưng chỉ mới thành công trong nuôi cấy tế bào Hela và L292. Các protein trong huyết thanh như albuminm fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển.
Kháng sinh thường được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định theo kinh nghiệm của người tiến hành nuôi cấy. Kháng sinh thường được dùng dưới dạng kết hợp. Có thể sử dụng Penicillin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm và chống nấm (Butler, 2004).
2.4.3. Điều kiện nuôi cấy
Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 37ᵒC và pH = 7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 37ᵒC thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39- 400C sẽ phá hủy tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy là rất quan trọng (Butler, 2004).
2.4.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là bị tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm thường do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thường bắt nguồn từ sự tiếp xúc của con người như là bàn tay, hơi thở, tóc. Môi trường và thiết bị ngày nay được cung cấp nhằm hạn chế tới mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm này. Nguy cơ này cũng có thể được giảm bớt hơn nữa bởi sự quan tâm cẩn thận đến từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy. Nhằm giảm bớt các nguồn tạp nhiễm, cần chú ý các điểm sau:
Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trước và sau quá trình nuôi cấy có thể làm giảm lượng vi khuẩn gây hại, có thể dùng găng tay y tế
Hạn chế những người tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành
Làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi quá trình nuôi cấy
Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác
Dùng chai nuôi cấy bằng plastic được tiệt trùng và chỉ dùng một lần
Mua môi trường và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004).
2.5. PHÂN LẬP VIRUS
2.5.1. Khái quát về phân lập virus
Virus là một thực thể đặc biệt, có khả năng biểu hiện những tính chất cơ bản của sự sống, trong điều kiện phải dựa hoàn toàn vào hệ thống enzyme và nguồn năng lượng của tế bào chủ (tế bào cảm thụ). Virus chỉ có thể nhân lên trong các môi trường tổ chức sống, do đó cần phải tạo hệ thống tế bào phù hợp để virus nhân lên. Có 3 hệ thống chính dùng để nuôi cấy virus trong phòng thí nghiệm là sử dụng động vật cảm thụ, phôi gà đang phát triển và môi trường tổ chức tế bào nuôi cấy (gồm tế bào dòng, tế bào sơ cấp và tế bào hữu hạn). Tuy nhiên, trong nghiên cứu virus với mục đích phân lập, giám định, chuẩn độ, xác định tính chất, hình thái virus, đặc biệt để chế tạo vaccine, phương pháp nuôi cấy trên môi trường tổ chức tế bào dòng đang được sử dụng rộng rãi, cho thấy vai trò quan trọng trong y học và thú y học. Nhờ phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào mà virus học đã bước vào thời đại vàng (Golden Age). Từ thập kỷ 50 đến thập kỷ 60 của thế kỷ 20 đã có trên 400 virus được phân lập và giám định đặc tính sinh học.
Phân lập virus trên tế bào dòng cho bệnh tích tế bào đặc trưng tùy chủng virus và tùy dòng tế bào. Sau khi virus xâm nhập và nhân lên trong tế bào, hầu hết các tế bào bị phá hủy. Người ta có thể đánh giá sự phá hủy tế bào bằng hiệu quả hủy hoại tế bào CPE (Cyto Pathogenic Effect) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử. Mỗi ổ tế bào bị hoại tử đó được gọi là một đơn vị plaque (Plaque forming unit – PFU). Căn cứ vào CPE khi quan sát trên kính hiển vi quang học có thể đánh giá được kết quả nuôi cấy virus.
Quá trình hình thành bệnh tích tế bào có quan hệ với liều virus gây nhiễm. Hàm lượng virus cao dẫn đến hủy hoại tế bào sớm khi virus chưa nhân lên, ảnh hưởng đến quá trình nhân lên của virus. Tuy nhiên, với liều lượng virus ở mức trung bình và thấp, tác động gây hủy hoại tế bào chậm, sự thay đổi hình dạng tế bào chậm và rõ ràng hơn. Do vậy, cần xác định liều gây nhiễm virus thích hợp để có được nồng độ nuôi cho hiệu giá virus tối ưu.
2.5.2. Phân lập Parvovirus phục vụ nghiên cứu sản xuất vaccine vô hoạt
Vaccine là yếu tố quyết định trong phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh do Parvovirus nói riêng. Sự biến chủng của virus cao nên virus luôn luôn có sự biến đổi, vì vậy vaccine sẽ phát huy hiệu quả cao hơn nếu chủng virus dùng làm giống gốc để sản xuất vaccine được phân lập từ thực địa.
Mục đích của phân lập virus là thiết lập virus giống gốc (Master Seed Viruses – MSVs) có đầy đủ yêu cầu cần thiết cho sản xuất vaccine. Chủng virus giống gốc lý tưởng được lựa chọn là có thể phát triển dễ dàng trong điều kiện nuôi cấy trên tế bào, có tính kháng nguyên rộng và ổn định. Chủng virus vaccine có thể được phân lập từ các chủng virus thực địa và xác định đặc tính sinh học cũng như sự ổn định qua các đời cấy chuyền trên tế bào dòng, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -80ºC.
Kháng nguyên virus dùng cho sản xuất vaccine phải có đầy đủ những tiêu chuẩn cần thiết, đặc biệt là:
Được nhận dạng chính xác bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen
Tính thuần khiết: Không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc,...
Chính vì vậy, cần phải có những xét nghiệm cần thiết đối với giống gốc đảm bảo đúng yêu cầu chất lượng cho sản xuất vaccine.
2.6. GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA. Giải trình tự bộ gen người, động vật và vi sinh vật giúp chẩn đoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ích con người.
2.7. CÂY PHÁT SINH CHỬNG LOẠI (PHYLOGENETIC TREE).
Các cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên cơ sở trình tự nucleotide được khuếch dại bằng PCR từ DNA của các chủng virus đã được phân lập. Thông thường người ta sử dụng các gen mã hóa cho lớp capsid protein, đặc biệt là gen đặc hiệu cho virus đó. Nhờ phương pháp này người ta xác định được quan hệ di truyền giữa các chủng virus phân lập bằng phần mềm MEGA 7.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu ở đây là 24 mẫu phân chó nghi mắc bệnh do
Parvovirus tại Viêng Chăn-CHDCND Lào.
Bảng 3.1. Thông tin các mẫu phân nghi mắc bệnh parvovirus
STT Tên Mẫu Giống Tháng Tuổi Tính Biệt Vaccine
Địa Điểm Lấy Ngày Lấy
1 L01 Chó lào 5 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 2 L02 Chi hua hua 4 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 3 L03 Alaska 3 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 4 L04 Fox 3 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 5 L05 Chó lào 4 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 6 L06 Chó lào 6 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 7 L07 Alaska 4 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 8 L08 Chó lào 5 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 9 L09 Corgi 4 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 10 L10 Fox sóc 6 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 11 L11 Corgi 4 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 12 L12 Bec Bỉ 4 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 13 L13 Chó lào 3 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 14 L14 Fox Sóc 3 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 15 L15 Lai 4 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 16 L16 Fox 5 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 17 L17 Bec Bỉ 5 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 18 L18 Chó lào 7 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 19 L19 Chó lào 4 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 20 L20 Lai 7 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 21 L21 Chó lào 3 Cái Không Vientiane-Lào 02/2019 22 L22 Pitt Bull 4 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 23 L23 Becgie 8 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019 24 L24 Chó lào 5 Đực Không Vientiane-Lào 02/2019
3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện tại phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y (Key laboratory for Veterinary Biotechnology)- Khoa Thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian: Từ tháng 12/2018 đến tháng 6/2019.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xác định sự có mặt của Parvovirus bằng phương pháp PCR.
Giải trình tự gen các chủng Parvovirus và xây dựng cây phả hệ.
Phân lập Parvovirus trên tế bào CRFK.
Xác định hiệu giá (TCID50) bằng phương pháp Spearman-Karber.
3.4. NGHIÊN VẬT LIỆU 3.4.1. Hóa chất 3.4.1. Hóa chất
Kit PCR – (iNtRON- 2x PCR Master mix solution- i-Taq)
Agarose – Invitrogen
Đệm chạy điện di 1X TBE
Hóa chất nhuộm gel (iNtRON- Redsafe)
DNA Ladder – Thermo
Hóa chất dùng cho nuôi cấy phân lập virus:
Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) – Gibco
FBS (Fetal Bovine Serum) – Sigma
1X Trypsin – Gibco
Kháng sinh gentamycin 1X PBS
3.4.2. Trang thiết bị máy móc
Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (Biohazard safety Cabinet)
Pipette chính xác 10µl, 20µl, 200µ, 1000µl.
Đầu côn tương ứng 10µl, 200µl, 1000µl.
Eppendorf tube 1,5ml, 200µ, ống ly tâm 15ml.
Khay đựng ống Eppendorf, găng tay, bông cồn, cân…
Nồi hấp nhiệt tiệt trùng
Các loại tủ lạnh 40C, -200C, -300C, -800C.
Máy chạy PCR: Sytem 9700 (GeneAmp).
Máy ly tâm bản Eppendorf (Refrigerated Microcentrifuge).
Máy ly tâm lạnh Centrifuge.
Máy vontex LaborA (Bioblock Scientific).
Các loại máy móc, vật liệu thông thường phòng thí nghiệm.
Găng tay, khẩu trang, bông cồn…
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣờng pháp lấy mẫu
Dựa vào triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính bằng kít test nhanh chúng tôi thực hiện lấy mẫu như sau:
Dùng pipette nhựa thu mẫu phân trực tiếp trên khay của chuồng nuôi, cho vào ống falcon 15ml, sau đó đem bảo quản trong tử -20ᵒC.
3.5.2. Phƣơng pháp tách DNA tổng số
Mẫu phân sau khi thu được đã được xử lý và bảo quản trong tủ -20ᵒC đến khi tiến hành thí nghiệm.
Vật liệu di truyền của Parvovirus là DNA, để tiến hành nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử, chủng virus cần được tiến hành tách chiết DNA tổng số. Kit Genomic DNA Mini Kit Blood/ Cultured Cell được sử dụng để tách chiết DNA. Cụ thể:
Bổ sung 900 µl dung dịch RBC Lysis Buffer vào 300 µl mẫu bệnh phẩm, lắc đều, để nhiệt độ phòng 10 phút, đem ly tâm 3000g trong 5 phút sau khi ly tâm, loại bỏ dịch nổi và cho thêm 100 µl dung dịch RBC Lysis Buffer, dùng Pipet hút lên xuống cho đồng đều.
Bổ sung tiếp 200 µl dung dịch GB Buffer, lắc mạnh, ủ ở nhiệt độ 60 ºC trong 10 phút ( cứ 3 phút đảo 1 lần ), để nhiệt độ phòng 5 phút. ( cùng thời gian đó ủ riêng 200 µl dung dịch Elution Buffer ở nhiệt độ 60 ºC ).
Bổ sung tiếp 200 µl dung dịch Absolute Etbanol, lắc mạnh, spindown, hút hết dung dịch sang cột lọc, đem ly tâm 14-16000g trong 5 phút, sau đó cuyển cột lọc sang ống mới ( bỏ ống cũ và dung dịch trong ống cũ ).
Bổ sung 400 µl dung dịch W1 Buffer vào ống có cột lọc, ly tâm 14- 16000g trong 1 phút, đổ dịch ra,
Bổ sung tiếp 100 µl dung dịch Elution Buffer ( đem ủ từ bước thứ 2 ), để yêu 3 phút, ly tâm 14-16000g trong 1 phút, sau đó bỏ cột lọc, đóng ống, vậy là ta đã thu được DNA .
3.5.3. Phƣơng pháp PCR
Sau khi đã có DNA, tiến hành phản ứng PCR Thành phần: Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần Số lƣợng (µl) DNA 3 Primer H-Forward 1 Primer H-Rev 1
2x PCR Master mix solution 10
Distilled water 5
Tổng 20µl
Thông tin cặp mồi được sử dụng:
Mix các thành phần lại với nhau, trộn đều sau đó đem đi chạy PCR với chu trình nhiệt độ như sau:
Bảng 3.3. Thông tin cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR (Canio Buonavoglia et al., 2001)
Tên mồi Trình tự mồi 5’-3’ Kích thƣớc
555for CAGGAAGATATCCAGAAGGA
583bp 555rev GGTGCTAGTTGATATGTAATAAACA
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR
Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian (phút) Chu kỳ