Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh vật học của l- 123docz.net

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh vật học của loài ruồi đục quả gây hạ

gây hại chính

- Ni tạo nguồn ban đầu theo phương pháp nuôi ruồi của Walker et al., (1996) và Pritam ; nguồn ruồi ban đầu được thu từ quả bị hại.

Thu những quả ổi có triệu chứng bị hại về đặt trong hộp để thu nhộng dưới mùn cưa ẩm mịn dày 0,5 cm. Tiến hành thu nhộng cứ 2- 3 ngày/lần bằng cách sàng, nhộng thu được chuyển vào hộp có lót mùn cưa ẩm, đặt hộp vào lồng ni ruồi theo dõi trưởng thành vũ hóa. Sau đó chuyển trưởng thành vào lồng ni cho ruồi ăn thường xuyên bằng hỗn hợp thức ăn đường trộn với yeast pha theo tỷ lệ tương ứng 3 phần đường: 1 phần yeast. Tiếp tục nhân nuôi tạo nguồn ban đầu và tiến hành các thí nghiệm. Ruồi đục quả B. dorsalis Hendel dùng cho nghiên cứu đặc điểm sinh vật học là thế hệ thứ 2 của quần thể loài ruồi thu được từ quả ổi.

* Nghiên cứu tập tính đẻ trứng của ruồi đục quả B. dorsalis

Thu đồng loạt 100 sâu non vào nhộng loài B. dorsalis trong cùng ngày, đặt 100 nhộng vào cùng lồng nuôi trưởng thành, sau khi nhộng vũ hóa trưởng thành, chọn 30 trưởng thành cái và trưởng thành đực vào lồng ni riêng có kích thước 30x30x30 cm, bên trong có thức ăn nhân tạo và cấp nước, sau 20 ngày tuổi, thu trưởng thành đực ra khỏi lồng nuôi. Chuẩn bị sẵn 10 quả ổi có độ

chín tương tự nhau, khơng bị xây sát, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh. Đặt bên trong 2 ống hình trụ để làm giá đỡ ổi, vào ngày 21 sau khi ruồi đục quả vũ hóa, lấy ra 2 quả ổi, để cho hết lạnh, cắt hết vỏ của một quả và một quả để nguyên vẹn. Đặt vào lồng thí nghiệm lúc 7h.30, đếm số lần viếng thăm của trưởng thành cái lúc 8h, 10h, 14h, 16h cùng ngày, mỗi lần quan sát là 30 phút. Sau 16h lấy cả 2 quả ổi ra khỏi lồng thí nghiệm, quan sát dưới kính lúp soi nổi số lượng trứng thu được trên mỗi quả (quả nguyên vẹn tìm các vết chích của con cái, dùng dao mổ để gẩy nhẹ lớp vỏ và đếm số trứng đẻ dưới lớp vỏ). Vào ngày tiếp theo lấy 2 quả ổi khác và làm tương tự thí nghiệm, thí nghiệm được thực hiện trong 5 ngày (Wigund et al., 2009).

Chỉ tiêu theo dõi:

- Số lần viếng thăm của trưởng thành cái lúc 8h, 10h, 14h, 16h; - Số trứng thu được trên mỗi quả.

* Nghiên cứu thời gian đẻ trứng của ruồi đục quả B. dorsalis

Thả 15 cặp trưởng thành (1 cái, 1 đực) ở 20 ngày tuổi vào lồng ni (kích thước 53x53x53 cm) ở phịng có nhiệt độ là 26- 280C, ẩm dộ 60- 80%. Thu trứng bằng miếng xoài ở 4 khoảng thời gian khác nhau trong ngày:

Công thức 1: thu trứng từ 8- 10h; Công thức 2: thu trứng từ 10- 12h; Công thức 3: thu trứng từ 14- 16h; Công thức 4: thu trứng từ 16- 18h.

Đếm số trứng thu được ở mỗi cơng thức, thí nghiệm được lặp lại trong 5 ngày. * Xác đinh đặc điểm hình thái của các pha phát phát dục

Tiến hành nuôi ruồi đục quả Bactorcera dorslalis Hendel trong phòng thí nghiệm theo mơ tả ở trên để đo kích thước lấy 30 cá thể của từng pha phát dục quan sát dưới kính lúp để mơ tả đặc điểm và đo kích thước (Prabhakar et al., 2012).

Đo chiều dài của 30 cá thể của các pha phát dục bằng cách đo từ đỉnh đầu đến cuối cơ thể (hậu môn).

* Theo dõi một số đặc điểm sinh học:

- Giai đoạn trứng: dùng miếng xoài để ruồi đẻ trứng và thu trứng đồng loạt một lần/ngày vào sáng sớm, rồi đặt lên miếng vải sau đó rải trứng trên các

đĩa thức ăn có thành phần là thịt quả ổi, khối lượng thức ăn là 0,3 gram/đĩa. Đặt đĩa trứng vào phịng có điều hịa ni ở nhiệt độ là 26- 280C, ẩm độ 60- 80%, để trong bóng tối. Sử dụng kính lúp soi nổi kiểm tra vỏ trứng sót lại trên đĩa thực hiện 2 lần/ ngày vào lúc 8 giờ sáng và 18 giờ chiều hàng ngày. Theo dõi 30 trứng.

Ghi nhận thời gian có quả trứng nở đầu tiên đến quả trứng cuối cùng nở. Tỷ lệ trứng nở được tính theo cơng thức.

Tổng vỏ trứng

Tỷ lệ trứng nở (%) = ------------------------- × 100

Tổng trứng theo dõi

+ Thời gian phát dục của pha trứng: thời gian trứng vừa được đẻ đến khi trứng nở thành ấu trùng. Tính trung bình thời gian phát dục của 30 cá thể theo cơng thức. X = N ni xi n i  1 .

Trong đó: X : Thời gian phát dục trung bình;

xi: Thời gian phát dục của cá thể n trong ngày thứ i; ni: số cá thể nở trong ngày thứ i;

N: Tổng số cá thể theo dõi.

+ Sau 7 ngày thu trứng, đếm tổng số trứng không nở trên đĩa. - Pha sâu non

Dùng bút lông gạt sâu non vừa nở lên đĩa thức ăn có thành phần là thịt quả ổi, lượng thức ăn là 0,3 gram/đĩa. Đặt đĩa có sâu non vào phịng ni ở nhiệt độ 26- 280C, ẩm độ 60- 80%, trong bóng tối. Quan sát sâu non vào nhộng ngày 2 lần vào 8 giờ sáng và 18 giờ hàng ngày. Theo dõi 30 sâu non. Ghi nhận thời gian có nhộng đầu tiên xuất hiện và thời gian nhộng cuối cùng xuất hiện.

Theo dõi các chỉ tiêu sau:

+ Thời gian phát dục của sâu non: Từ khi sâu non mới nở đến khi sâu non vào nhộng (tính giá trị trung bình của 30 cá thể theo dõi).

Số nhộng thu được

+ Tỷ lệ vào nhộng (%) = ----------------------------- × 100 Tổng số sâu non theo dõi - Pha nhộng

Dùng bút lơng đặt nhộng vào hộp có sẵn mùn cưa sạch, sau đó dùng mùn cưa ẩm phủ kín nhộng một lớp dày 1,5 cm. Đánh dấu từng hộp. Để hộp trong phòng nhiệt độ 26- 280C, ẩm độ 60- 80%, bên ngoài hộp phủ nilong đen. Quan sát nhộng vũ hóa trưởng thành mỗi ngày hai lần vào 8 giờ sáng và 18 giờ chiều. Xác định giới tính của trưởng thành (đực/cái). Theo dõi 30 nhộng (30 hộp mùn cưa nhỏ).

Theo dõi chỉ tiêu sau:

+ Thời gian phát dục: thời gian bắt đầu vào nhộng đến khi nhộng vũ hóa.

X = N ni xi n i  1 .

Trong đó: X : Thời gian phát dục trung bình;

xi: Thời gian vào nhộng của cá thể n trong ngày thứ i; ni: Số cá thể vào nhộng trong ngày thứ i;

N: Tổng số cá thể theo dõi.

+ Thời gian phát dục của con đực và con cái: Thời gian từ khi vào nhộng đến khi nhộng vũ hóa trưởng thành.

X = N ni xi n i  1 .

Trong đó: X : Thời gian phát dục trung bình của con đực (cái);

xi: Thời gian vào nhộng của cá thể đực (cái) n trong ngày thứ i; ni: Số cá thể vào nhộng đực (cái) trong ngày thứ i;

N: Tổng số cá thể đực (cái) theo dõi.

- Giai đoạn trưởng thành: Tách và ghép cặp trưởng thành ngay sau khi vũ hóa vào lồng ni cá thể. Nuôi trưởng thành bằng hỗn hợp thức ăn nhân tạo.

Nước được cung cấp bằng xốp mút nối trên đỉnh lồng tới hộp nước. Đặt lồng ni vào phịng ở nhiệt độ 26- 280C, ẩm độ 60- 80%, chiếu sáng 12 tiếng/ ngày. Quan sát trưởng thành đẻ trứng hàng ngày bằng cách dùng miếng aga để trên đỉnh lồng. Kiểm tra mỗi ngày hai lần vào buổi sáng và chiều tối. Quan sát 30 ruồi trưởng thành trong lồng nuôi ruồi và theo dõi các chỉ tiêu.

+ Thời gian trước đẻ trứng: Từ khi trưởng thành vũ hóa đến khi đẻ lứa trứng đầu tiên

(tính giá trị trung bình của 30 cá thể trưởng thành theo dõi) + Tuổi thọ trung bình (ngày):

A = N ni ai n i  1 .

Trong đó: A : Tuổi thọ trung bình;

ai: Tuổi thọ của cá thể n trong ngày thứ i; ni: Số cá thể chết trong này thứ i;

N: Tổng số cá thể theo dõi. * Nghiên cứu tỷ lệ giới tính ở các pha trưởng thành

Theo dõi 30 nhộng. Những nhộng này đặt trong phòng ở mức nhiệt 26- 280C, ẩm độ 60- 80%, bên ngoài hộp nhộng có phủ nilon đen. Sau khi trưởng thành vũ hóa chuyển vào lồng ni ở điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm (ẩm độ khoảng 60- 80%, nhiệt độ 26- 280C ) với thức ăn ni trưởng thành. Sau vũ hóa 1 ngày tiến hành đếm số trưởng thành đực và cái.

* Phương pháp nghiên cứu sức đẻ trứng của trưởng thành cái

Thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ là 26- 280C, ẩm độ 60- 80%. Thu các nhộng có khối lượng tương đương nhau từ các cặp bố mẹ từ thế hệ thứ 2 ở cùng điều kiện nuôi. Tách và ghép cặp ngay các trưởng thành vừa vũ hóa và thả vào lồng nhựa trong suốt (có đường kính 8cm, cao 30cm) mỗi lồng là một cặp trưởng thành (1 đực, 1 cái). Nuôi 15 cặp trưởng thành, nuôi bằng đường nhão và nước trong 3 ngày đầu, từ ngày thứ tư trở đi nuôi bằng thức ăn cho trưởng thành. Thu trứng bằng miếng aga (hình vng có cạnh dài 3 cm, dày 3 mm); hàng ngày đặt miếng aga lên đỉnh lồng nuôi trưởng thành và đếm số trứng đẻ

được vào mỗi buổi sáng. Ghi chép số trứng đẻ được hàng ngày trong suốt thời gian sống của 15 cặp trưởng thành.

Theo dõi các chỉ tiêu sau:

- Thời gian đẻ trứng của trưởng thành trong suốt thời gian sống. - Số trứng trung bình đẻ được hàng ngày của các cặp trưởng thành. - Tổng số trứng do một trưởng thành cái đẻ trong suốt thời gian sống.

Hình 3.2. Lồng ni nguồn ruồi đục quả

Hình 3.3. Lồng ni cá thể ruồi đục quả

Hình 3.4. Phương pháp thu trứng ruồi đục quả 3.5.3. Xác định hiệu quả của một số biện pháp phòng trừ ruồi đục quả bằng bẫy

Tiến hành thử nghiệm ba loại bẫy dẫn dụ chứa thuốc là Methy eugenol (ME), CUE lure eugenol (CUE) và protein thủy phân (Pb) ở ba vườn ổi chính, diện tích mỗi vườn là 1000m2. Thực hiện treo bẫy, thu thập và tính tốn số liệu theo Tiêu Chuẩn quốc tế về biện pháp kiểm dịch thực vật: ISPM số 26: Thiết lập vùng không nhiễm dịch hại ruồi đục quả Tephritidae (Etablishment of pest free areas for fruit flies Tephritidae) năm 2011.

Quy trình đặt bẫy

- Phân bố không gian của bẫy;

- Số lượng bẫy đặt (theo ISPM số 26, 2011).

Bẫy ME, CUE và Pb, mỗi loại bẫy là 2 bẫy/vườn/1000m2 được đặt tại chung ở cùng một vườn, thí nghiệm được thực hiện trên 3 vườn ổi, các vườn cách nhau khoảng 1km. Đặt 3 loại bẫy ở điểm râm mát có đốm nắng và ở phía cây đón gió, đặt ở các hướng đơng của cây, phía đón ánh nắng sớm. Móc treo bẫy bơi mỡ bị để ngăn kiến ăn mất ruồi đục quả bắt được.

- Lập bản đồ bẫy

Ghi chép lại các vị trí đặt bẫy, lập bản đồ vị trí các bẫy, sử dụng GPS. - Kiểm tra và bảo trì bẫy

Kiểm tra và thay thuốc 15 ngày/lần. Lau chùi bẫy sạch sẽ sau mỗi lần thu Thời gian kiểm tra bẫy và thu mẫu 15 ngày/lần.

- Thu mẫu

Đến kỳ thu mẫu, dùng bút lơng gạt trưởng thành ruồi có trong bẫy vào lọ nhựa có chiều cao là 8cm, rộng 5cm. Điền các thông tin (địa điểm, ngày thu, chất dẫn dụ) lên vỏ hộp.

3.5.3.1. Đánh giá ảnh hưởng của các mật độ treo bẫy ME

Tiến hành đặt bẫy ME với ba mật độ bẫy khác nhau tại thời điểm hình thành quả, các mật độ bẫy được đặt ở các vườn khác nhau, các vườn cách nhau 1 m, có cùng diện tích là 1000m2theo cơng thức dưới đây:

- CT1: Vườn 1: 2 bẫy; - CT2: Vườn 2: 4 bẫy; - CT3: Vườn 3: 6 bẫy.

Phương pháp đặt: bẫy ME ở ba công thức cùng được đặt theo quy tắc: Các bẫy đặt cách nhau 50 m ở cùng độ cao là 1,5 m, đặt ở điểm râm mát có đốm nắng và ở phía cây đón gió, đặt ở các hướng Đơng của cây, phía đón ánh nắng sớm. Móc treo bẫy bơi mỡ bị để ngăn kiến ăn mất ruồi đục quả thu được.

Kiểm tra và thay thuốc 15 ngày/lần. Lau chùi bẫy sạch sẽ sau mỗi lần thu Thời gian kiểm tra bẫy và thu mẫu 15 ngày/lần.

- Thu mẫu

Đến kỳ thu mẫu, dùng bút lơng gạt trưởng thành ruồi có trong bẫy vào lọ nhựa có chiều cao là 8cm, rộng 5cm. Điền các thông tin (địa điểm, ngày thu) lên vỏ hộp.

Chỉ tiêu theo dõi: Lượng ruồi vào bẫy (con/bẫy/15 ngày).

- Tính lượng ruồi bắt được trên một bẫy một ngày (FTD) (con/ bẫy/15 ngày) FTD= F/ TD

T: Tổng số bẫy;

D: Số ngày trung bình giữa các lần kiểm tra bẫy.

- Tỷ lệ quả bị hại: Điều tra theo 5 điểm chéo góc, 5 cây/ điểm. Cố định điểm điều tra, thu hái ngẫu nhiên 100 quả khi quả chín ở các tầng của cây ổi. Đem về phịng thí nghiệm, bổ quả để xác định số quả bị hại do ruồi đục quả gây ra.

Hình 3.5. Bẫy được treo cách mặt đất 1,5m

Hình 3.6. Mẫu ruồi đục quả thu được từ bẫy

3.5.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của chiều cao đặt bẫy ME

Tiến hành đặt bẫy ME ở 3 độ cao khác nhau tại thời điểm hình thành quả (17/5/2016) :

CT1: 1 bẫy ở độ cao 1m; CT2: 1 bẫy ở độ cao 1,5m; CT3: 1 bẫy ở độ cao 2m.

Độ cao của bẫy được tính từ mặt đất cho đến cửa bẫy.

Đặt bẫy của 3 công thức cùng trên một vườn ổi có diện tích vườn 1000 m2, cây ổi có chiều cao trung bình khoảng 2,5m, chiều cao từ đất tới tán lá dưới của cây ổi trung bình là 1,5m, độ dày tán lá trung bình là 1 m. Đặt bẫy ở điểm râm mát có đốm nắng và ở phía cây đón gió, đặt ở các hướng Đơng của cây, phía đón ánh nắng sớm. Móc treo bẫy bơi mỡ bị để ngăn kiến ăn mất ruồi đục quả thu được.

Kiểm tra và thay thuốc 15 ngày/lần. Lau chùi bẫy sạch sẽ sau mỗi lần thu Thời gian kiểm tra bẫy và thu mẫu 15 ngày/lần.

- Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ ruồi vào bẫy (con/bẫy/15 ngày).

- Tính lượng ruồi bắt được trên một bẫy một ngày (FTD) (con/ bẫy/15 ngày). FTD= F/ TD

F: Tổng số ruồi đục quả bắt được; T: Tổng số bẫy;

D: Số ngày trung bình giữa các lần kiểm tra bẫy.

3.5.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm đặt bẫy ME

Tiến hành đặt bẫy ME nhắc lại ở 3 vườn vào các thời điểm khác nhau, với số lượng bẫy là 2 bẫy/vườn, diện tích vườn: 1000m2.

- CT1: Đặt bẫy trước cho đến khi ra hoa (từ tháng 3 – tháng 4); - CT2: Đặt bẫy khi bắt đầu ra hoa (từ tháng 4- tháng 5);

- CT3: Đặt bẫy khi hình thành quả (từ tháng 5- tháng 6); - CT4: Đặt bẫy khi quả bắt đầu chín (tháng 6- tháng 7); - CT5: Đặt bẫy khi quả chín rộ (tháng 8- 9).

- Các bẫy ở các công thức và ở cả 3 vườn được đặt treo theo cùng một phương pháp: các bẫy cách nhau 50 m ở cùng độ cao là 1,5 m, đặt ở điểm râm mát có đốm nắng và ở phía cây đón gió, đặt ở các hướng Đơng của cây, phía đón ánh nắng sớm. Móc treo bẫy bơi mỡ bị để ngăn kiến ăn mất ruồi đục quả thu được.

Kiểm tra và thay thuốc 15 ngày/lần. Lau chùi bẫy sạch sẽ sau mỗi lần thu Thời gian kiểm tra bẫy và thu mẫu 15 ngày/lần.

- Thu mẫu

- Tính lượng ruồi bắt được trên một bẫy một ngày (FTD) (con/ bẫy/15 ngày) FTD=F/ TD

F: Tổng số ruồi đục quả bắt được; T: Tổng số bẫy;

D: Số ngày trung bình giữa các lần kiểm tra bẫy.

3.5.4. Xử lý, bảo quản, và giám định mẫu vật

- Mẫu khô: đối với trưởng thành ruồi đục quả, sau khi thu thập về, giám

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh vật học của loài ruồi đục quả gây hạ

VẬT LIỆU VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU