3.4.1. Phương pháp chuẩn bị bò thì nghiệm
Năm bò đã được bấm số tai theo mẫu: SL01-SL05 thuộc Bộ NN&PTNT. Bò có thể trạng tốt, không mắc các bệnh truyền nhiễm, bệnh nội khoa, bệnh ký sinh trùng và đặc biệt là không có các bệnh về sinh sản. Khám cơ quan sinh dục không viêm nhiễm, không dị hình. Bò thí nghiệm sau khi mua về, nuôi ổn định và tiến hành cắt bỏ buồng trứng.
Chuẩn bị thức ăn hàng ngày: Thức ăn được chúng tôi chuẩn bị theo hai
mùa (mùa mưa và mùa khô).
Bảng 3.2. Thức ăn mùa mưa
Loại thức ăn Khối lượng Cỏ xanh ≈ 35kg/con/ngày Cám hỗn hợp ≈ 1,5kg/con/ngày
Bảng 3.3. Thức ăn mùa khô
Loại thức ăn Khối lượng Ủ chua ≈10-15kg/con/ngày Cám hỗn hợp ≈1,5kg/con/ngày Cỏ xanh (nếu có) ≈15kg/con/ngày
Cỏ xanh được trồng cách trại khoảng 500 m, với diện tích khoảng 3000 m2.
Hàng ngày, cỏ được vận chuyển về trại, phay nhỏ bằng máy phay cỏ trước khi cho bò ăn.
Hàng ngày, bò được tắm rửa sạch sẽ, tiếp xúc thường xuyên với bác sỹ thú y để thuận tiện cho công tác lấy máy và điều trị khi cần.
Phân và nước tiểu của bò được dọn 2 lần/ngày. Toàn bộ phân và nước tiểu được xử lý qua hệ thống biogas trước khi thải ra ngoài môi trường.
3.4.2. Phương pháp cắt buồng trứng bò thí nghiệm Tạo pha thể vàng để cắt buồng trứng bò thí nghiệm Tạo pha thể vàng để cắt buồng trứng bò thí nghiệm
Gây động dục ở bò thí nghiệm, sau 7 ngày xác định sự hình thành của thể vàng bằng phương pháp khám lâm sàng qua trực tràng. Tiến hành cắt bỏ buồng trứng trên những bò có thể vàng để đảm bảo an toàn, do trong giai đoạn động dục hoạt động mạch quản tăng mạnh để đáp ứng nhu cầu trao đổi chất, dẫn đến tăng nguy cơ nội xuất huyết khi thực hiện phẫu thuật.
Ngày 1 Ngày 7 Ngày 8
Biểu đồ 3.1. Công thức tạo pha thể vòng trên bò thí nghiệm
Sử dụng tổ hợp hormone sinh sản để gây động dục, ngày thứ nhất đặt vòng CIDR vào âm đạo bò bằng applicator đồng thời tiêm GnRH, đến ngày thứ
7 tiến hành rút vòng CIDR và tiêm PGF2α. Ngày thứ 8 tiêm nhắc lại GnRH,
quan sát biểu hiện động dục như bỏ ăn, cơ quan sinh dục chảy dịch, niêm mạc âm đạo đỏ… 7 - 10 ngày sau khi bò có biểu hiện động dục khám lâm sàng qua trực tràng để xác định sự hình thành của thể vàng trước khi tiến hành phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng.
Phương pháp phẫu thuật cắt buồng trứng bò
Cố định bò vào gióng sắt 4 trụ chắc, buộc mũi kéo về phía trước, bịt mắt bò trong quá trình phẫu thuật, tiến hành buộc đuôi kéo về phía trước để dễ dàng thao tác trong phẫu thuật.
Đi găng tay sản khoa có làm trơn bằng vaselin tiến hành moi phân và kích thích trực tràng để đi phân hết. Dùng nước và xà phòng rửa sạch hậu môn và cơ quan sinh dục bên ngoài, sau đó lau khô và sát trùng bên ngoài bằng cồn iod. Sau đó tiến hành rửa âm đạo bằng dung dịch iod 0,2%.
CIDR Phẫu thuật cắt
buồng trứng Động dục
GnRH PGF2α
Tay bác sĩ thú y thực hiện phẫu thuật rửa kỹ bằng xà phòng, sát trùng tay 3 lần bằng cồn trắng và 3 lần bằng cồn iod. Chuẩn bị dao mổ, tiến hành dùng vải gạc vô trùng quấn chặt đầu dao và cán dao mổ chỉ để hở một phần nhỏ mũi dao hạn chế nguy hiểm cho người phẫu thuật và âm đạo bò trong quá trình phẫu thuật.
Thao tác trong phẫu thuật
Dùng ngón tay trỏ và ngón tay cái mở mép âm môn, tay phải cầm dao và cán dao đã được cuốn vải gạc vô trùng, cầm gọn trong lòng bàn tay, khi đưa tay phải và dao mổ vào trong âm đạo, tiến hành ngửa lòng bàn tay dùng mũi dao rạch một đường dài khoảng 3 – 4 cm phía trên âm đạo gần cổ tử cung (cách cổ tử cung 2cm). Sau đó bỏ dao mổ ra ngoài, dùng pank đưa vào âm đạo để kẹp làm thủng tương mạc tử cung, rút pank ra ngoài và đưa tay phải vào, chụm năm ngón tay lại đưa vào vết mổ, xé rộng vết mổ, đưa tay qua tìm buồng trứng bên phải, kéo buồng trứng vào trong âm đạo, lúc này tay trái người phẫu thuật đưa dụng cụ cắt buồng trứng vào trong âm đạo. Dùng tay phải đưa buồng trứng vào thòng lọng xích của dụng cụ cắt chuyên dụng và ra hiệu cho người phụ mổ bắt đầu xiết bằng cách kéo ở bên ngoài người phụ mổ thắt buồng trứng một cách từ từ đề vừa cắt vừa cầm máu khi buồng trứng bị đứt thì rơi vào lòng bàn tay phải người mổ chính. Sau khi cắt xong, người phụ mổ tiến hành rút dụng cụ ra và tay phải người mổ chính đưa buồng trứng ra bên ngoài. Tiến hành cắt buồng trứng bên trái theo phương pháp tương tự. Sau khi cắt bỏ hai buồng trứng bên phải và bên trái, dùng bông cồn tẩm iod sát trùng vết mổ âm đạo. Dùng kháng sinh 3 ngày liên tục phòng nhiễm trùng kế phát (Sử Thanh Long và cs., 2015). Bảo quản mẫu buồng trứng trong dung dịch formol, dán nhãn ghi rõ tên.
Sau phẫu thuật tiêm: Vitamin K: 8 ml/con
Amoxicillin 15%: 1 ml/10 kg P
Hàng ngày tiêm bổ sung Amoxicillin 15%, Ketovet, quan sát tình trạng sức khỏe, đo nhiệt độ trực tràng bò thí nghiệm.
3.4.3. Phương pháp phân tích vỏ silicon tẩm progesteronecủa vòng CIDR Phương pháp hóa học Soxhlet Phương pháp hóa học Soxhlet
Hình 3.1. Phương pháp hóa học Soxhlet
Cấu tạo bộ Soxhlet gồm 3 bộ phận chính: Bình ngưng, cốc tràn chứa sản phẩm thử và bình chứa dung môi chiết.
Tiến hành: Cắt mỏng vòng CIDR gói vào giấy lọc cho vào cốc tràn, cho dung môi vào bình chứa dung môi chiết đun sôi lên. Hơi nước bay lên gặp lạnh đột ngột ở đỉnh bình ngưng tạo nước chảy xuống buồng khai thác, lúc này nhiệt độ trong cốc tràn cao gần như được đun sôi làm tan chảy progesterone tẩm trong vòng CIDR chảy vào ống thu nước xuống bình sôi. Tại đây, tiếp tục bay hơi và cứ liên tục như thế đến khi khối lượng chất lỏng đạt một giá trị cụ thể thì tiến hành lấy ra chạy li tâm dung dịch thu được, còn lại bột mịn đem cân trọng lượng và xác định lượng progesterone có trong vòng CIDR.
Phương pháp ngâm trích ly
Phương pháp ngâm trích ly trong cồn 900 (cồn tuyệt đối) dựa vào cơ chế
progesterone tan hoàn toàn trong cồn 900. Ngâm vòng CIDR trong cồn 900 một
thời gian nhất định đủ để progesterone tan hoàn toàn. Sau đó lấy vòng CIDR ra cân trọng lượng và xác định lượng progesterone có trong vòng CIDR.
Phương pháp chạy quang phổ đối chiếu progesterone
Bột tẩm trong vòng CIDR có sẵn trên bề mặt được nạo ra bằng dùng dụng cụ chuyên dụng. Kết hợp với KBr (chất mang) chạy phổ trên máy quang phổ hồng ngoại.
Progesterone dự kiến tẩm vào vòng sản phẩm do Việt Nam sản xuất cũng áp dụng phương pháp tương tự.
Phương pháp chụp silicon bằng kính hiển vi điện tử quét
Sau khi trích ly progesterone trong vòng CIDR, mẫu silicon được cho vào kính hiển vi điện tử quét để phân tích cấu trúc.
3.4.4. Phương pháp định lượng progesterone trong máu bò thí nghiệm Phương pháp lấy máu bò Phương pháp lấy máu bò
Buộc cao mũi bò vào gióng, dùng bông cồn sát trùng tại chính giữa đốt thứ 2 của đuôi, vì tại vị trí này có tĩnh mạch đuôi chạy qua. Cắm kim vuông góc với đuôi cho tới khi chạm vào xương đuôi, hơi rút mũi kim ra và điều chỉnh kim để kim nằm trong lòng mạch. Mỗi lần lấy khoảng 2 ml – 3 ml máu, sau đó tháo kim khỏi xylanh và cho máu nhẹ nhàng vào ống đựng mẫu máu rồi lắc nhẹ, ghi rõ tên mẫu, giờ lấy máu và ngày tháng lấy máu. Với ống nghiệm lấy máu để chắt huyết thanh cần hết sức nhẹ nhàng, giữ nguyên ống nghiệm ở tư thế
nghiêng 450 so với mặt đất.
Bảo quản lạnh trong hộp đựng mẫu, tránh ánh sáng và vận chuyển nhẹ nhàng và cần tiến hành định lượng càng sớm càng tốt.
Phương pháp đặt vòng mẫu tẩm progesterone
Do mẫu vòng chưa có thiết bị hỗ trợ đặt nên các mẫu được đưa vào bằng tay. Cố định bò vào gióng, cố định hai chân sau, cố định đuôi, vệ sinh sạch âm
môn bằng cồn iod hoặc cồn 700. Sử dụng găng tay sản khoa, xoa đều vaselin, rồi
cầm các mẫu gọn trong lòng bàn tay. Nhẹ nhàng đưa tay vào âm đạo cho tới khi chạm tới bên ngoài cổ tử cung, thả mẫu bên trong âm đạo
Phương pháp định lượng progesterone
Bằng phương pháp enzyme miễn dịch (ELISA) được thực hiện tại bệnh viện MEDLATEC.
3.4.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh buồng trứng
1. Bệnh thể vàng tồn lưu là thể vàng không bị thoái hóa và chu kỳ động dục không được biểu hiện. Nguyên nhân có thể do nhiều yếu tố gồm tử cung viêm tích mủ, dịch nhầy trong tử cung, thai chết lưu (phù thai), thai gỗ… Khám qua trực tràng tìm buồng trứng, dùng ngón tay cái xoa nhẹ trên bề mặt buồng trứng thấy có 1 khối nhỏ (bằng hạt ngô, đậu tương, hạt lạc hoặc to hơn) nhô lên khỏi bề mặt buồng trứng, cứng, có chân đế, ranh giới giữa thể vàng và bề mặt buồng trứng rõ (Sử Thanh Long và cs., 2014).
2. Bệnh u nang buồng trứng là những nang trứng không rụng và lưu lại lâu trên buồng trứng, đường kính lớn hơn 2,5cm. Bò bị u nang thường biểu hiện động dục thường xuyên và liên tục không theo chu kỳ. Tiến hành sờ khám qua trực tràng thấy buồng trứng to hơn bình thường (bằng quả trứng gà), sờ trên bề mặt buồng trứng thấy có một u nang (hoặc nhiều hơn) cảm giác mềm, dễ vỡ và có vách ngăn không rõ ràng (Sử Thanh Long và cs., 2014).
3. Buồng trứng không hoạt động có hình thái dẹt, cứng, nhỏ, không cân đối (một bên to, một bên nhỏ) và bề mặt buồng trứng trơn nhẵn không có thể vàng và không có nang trứng. Bò không xuất hiện chu kỳ động dục và thường gặp ở những con có thể trạng gầy yếu, suy dinh dưỡng (Sử Thanh Long và cs., 2014).
Để kết luận bò bị bệnh buồng trứng, tiến hành kiểm tra hai lần khám liên tiếp cách nhau 7-10 ngày (Sử Thanh Long và cs., 2014). Dưới đây là bảng kết quả chẩn đoán bệnh buồng trứng sau hai lần kiểm tra.
Bảng 3.4. Phương pháp chẩn đoán khám buồng trứng sau hai lần kiểm tra cách nhau 7-10 ngày
Kiểm tra buồng trứng Lần 1 Ngày thứ nhất
Lần 2
7-10 ngày sau Kết luận buồng trứng Thể vàng + - + + + - Thể vàng tồn lưu Sinh lý bình thường Sinh lý bình thường Nang trứng + - + + + - U nang buồng trứng Sinh lý bình thường Sinh lý bình thường Buồng trứng - - Không hoạt động
3.4.6. Phương pháp phát hiện động dục bò
Để cho việc phát hiện bò sữa động dục được tốt và hiệu quả cần phải có sổ sách ghi chép các số liệu sinh sản của mỗi con bò gồm tuổi, ngày đẻ, lần đẻ, lần động dục gần nhất.
Quan sát để phát hiện động dục ba lần trong một ngày (sáng, trưa, tối), tốt nhất là quan sát vào sáng sớm và chiều tối. Thời gian quan sát phụ thuộc vào số lượng gia súc trong đàn, thông thường mỗi lần từ 15 đến 30 phút.
3.4.7. Biểu hiện bò động dục
Bò ít ăn, giảm sữa, hay nhớn nhác nhìn ngó, kêu rống, thích gần hít ngửi âm hộ và nhảy lên lưng con khác hoặc để con khác nhảy (nếu con ở dưới đứng yên thì bản thân con đó đang động dục, nếu con ở dưới chạy thì con nhảy lại là con động dục trừ trường hợp cả hai con đều động dục).
Âm hộ sưng đỏ, chảy nước nhờn trong, lỏng sau đặc dần, kiểm tra bên trong thấy tử cung cứng hơn bình thường.
3.5. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Thí nghiệm 1: Sử dụng mẫu tẩm 1,9 gr progesterone Thí nghiệm 1: Sử dụng mẫu tẩm 1,9 gr progesterone
Đối tượng nghiên cứu là các mẫu tẩm khoảng 1,9 gr progesterone và vòng CIDR nhập New Zealand làm đối chứng.
Biểu đồ 3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 1 sử dụng mẫu tẩm 1,9 gr progesterone
Hình 3.2. Mẫu thử nghiệm và vòng CIDR
0 giờ 3 giờ ngày 1 ngày 9 ngày 13 Lấy máu sau mỗi 24h
Đặt mẫu thử Rút mẫu thử
Sau khi đặt vòng vào âm đạo bò, tiến hành lấy máu theo các thời điểm, gồm: (1) sau 3 giờ đặt vòng, (2) liên tiếp 9 ngày sau khi đặt vòng, (3) 4 ngày sau khi rút mẫu vòng ra khỏi âm đạo bò thí nghiệm.
Do bò Việt Nam có thể trạng nhỏ, nên chúng tôi tiến hành giảm lượng progesterone tẩm trong mẫu từ khoảng 1,9 gr xuống khoảng 1,3 gr để tìm ngưỡng tẩm thấp nhất vẫn có hiệu quả.
Thí nghiệm 2: Sử dụng mẫu tẩm 1,3 gr progesterone
Mẫu máu được lấy vào các thời điểm, gồm: (1) trước khi đặt mẫu, (2) trong thời gian 7 ngày đặt mẫu và (3) sau khi rút mẫu 24h.
Biểu đồ 3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2 sử dụng mẫu tẩm 1,3 gr progesterone
Thí nghiệm 3: So sánh điều trị giữa phác đồ sử dụng vòng CIDR và vòng ProB
Bò thí nghiệm được chia làm 2 nhóm, 1 nhóm áp dụng phác đồ điều trị sử dụng vòng tẩm ProB và 1 nhóm sử dụng vòng CIDR.
Do số lượng bò thí nghiệm còn hạn chế, nên nghiên cứu không phân theo 3 bệnh buồng trứng và áp dụng chung 1 phác đồ điều trị.
0 giờ 30 phút ngày 1 ngày 7 ngày 8
Lấy máu sau mỗi 24h Đặt mẫu thử Rút mẫu thử
Nhóm 1: Điều trị với phác đồ sử dụng vòng CIDR
Ngày 1 Ngày 7 Ngày 8 Nhóm 2: Điều trị với phác đồ sử dụng vòng ProB
Ngày 1 Ngày 7 Ngày 8
Hiệu quả điều trị bệnh buồng trứng ở bò thí nghiệm được đánh giá qua khả năng động dục trở lại. CIDR Động dục GnRH PGF2α GnRH ProB Động dục GnRH PGF2α GnRH
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ CẮT BUỒNG TRỨNG BÒ
Để giảm thiểu nguy cơ xuất huyết nội trong quá trình phẫu thuật cắt buồng trứng, các bò thí nghiệm được ứng dụng tổ hợp hormone sinh sản để đưa vào giai đoạn thể vàng trong chu kỳ động dục, kết quả được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ tạo pha thể vàng trên bò thí nghiệm
Bò thí nghiệm
(con) Bò ở pha thể vàng (con) Tỷ lệ (%)
05 05 100%
Tỷ lệ bò ở pha thể vàng tại thời điểm tiến hành cắt buồng trứng đạt 100%. Phương pháp tạo pha thể vàng được ứng dụng theo nguyên lý của
phương pháp Ovsynh (1) tiêm GnRH vào ngày 0, (2) tiêm PGF2 vào ngày
thứ 7, (3) tiêm GnRH lần hai sau đó 1 ngày (Pursley et al., 1995). Liều tiêm
GnRH đầu tiên nhằm thúc đẩy quá trình rụng trứng của những nang trứng trội và bắt đầu một đợt sóng nang mới. Việc tiêm GnRH vào giai đoạn bất kỳ của chu kỳ động dục trên bò đem lại tác dụng (1) tăng số lượng nang có kích cỡ trung bình trong 3 ngày điều trị, (2) loại bỏ các nang trội bằng quá trình rụng trứng hay thoái hoá nang trứng (atresia) và (3) kích thích hình thành sóng
nang mới trong 2-3 ngày điều trị (Jazayeri et al., 2010). Sau đó, tiêm PGF2
sẽ có tác dụng phá vỡ thể vàng, làm tăng nồng độ estrogen trong máu khiến
cho bò có biểu hiện động dục (Pursley et al., 1995). Liều tiêm GnRH thứ hai
có tác dụng gây rụng trứng trên nang trội và hình thành thể vàng tiếp theo (Senger, 2003). Trong một số trường hợp, sự biến động của quá trình động dục và rụng trứng, nhiều bò xảy ra sớm hơn so với sinh lý bình thường
(Rivera et al., 2004, 2005), khiến cho nhiều bò động dục nhưng hiện tượng
rụng trứng chưa xảy ra, dẫn đến chưa hình thành thể vàng, do đó để đảm bảo bò ở pha thể vàng khi thực hiện phẫu thuật cắt buồng trứng chúng tôi kết hợp đặt vòng CIDR trong vòng 7 ngày.
Chúng tôi tiến hành cắt bỏ buồng trứng bò theo phương pháp ngoại khoa của Nhật Bản, dưới sự giúp đỡ của chuyên gia Toshihiko đến từ đại học Yamaguchi, Nhật Bản. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả cắt buồng trứng ở bò thí nghiệm
Bò phẫu thuật SL - 01 SL - 02 SL - 04 SL - 05 Thời điểm cắt Có thể vàng Có thể vàng Có thể vàng Có thể vàng Sau phẫu thuật Tốt Tốt Hoảng loạn Tốt
Có tổng số 5 con bò thí nghiệm và chúng tôi tiến hành cắt bỏ hoàn toàn 8 buồng trứng thuộc 4 bò, còn 1 bò SL-03 do cơ quan sinh dục bé không cắt được