2.2.1. Trên thế giới
Bệnh tai xanh đã gây thiệt hai ở Hoa Kỳ lên đến 664.000.000 USD tương đương với 584.301.294,82 euro (€) còn ở châu Âu số lợn nhiễm bệnh tai
xanh (PRRS) đã lên tới 7 triệu con nái và 150 triệu con lợn thịt đã bị ảnh hưởng bởi PRRS trong năm 2013.
Otake et al., ( 2000) khi nghiên cứu về kháng thể của lợn mắc PRRS và thấy rằng: nếu lợn con được bú sữa đầu thì sẽ có kháng thể PRRS trong huyết thanh từ ngày thứ tư sau khi sinh. Jenny G.Cho và cộng sự thuộc khoa thú y, trường Đại học Minesota của Mỹ, khi nghiên cứu về những đặc điểm của virus PRRS và triệu chứng lâm sàng của lợn khi bị bệnh ở Mỹ và một số nước Châu Âu đã kết luận rằng: các chủng virus ở mỹ và Châu Âu có sự khác biệt nhau về bộ gen, tức là virus ở 2 nơi này có sự biến đổi về cấu trúc. Điều đó chứng tỏ virus PRRS có khả năng biến chủng ( Otake Setal. ,2000).
Nghiên cứu về trình tự gen của chủng virus cường độc ở Trung Quốc, Tian Kegong (2007) thu được kết quả như sau: ở một số ổ dịch, bộ gen của virus PRRS tương đồng 93,2 – 94,2% với bộ gen của chủng VR2332 (Bắc Mỹ). Một số ổ dịch khác lại thấy bộ gen của virus PRRS tương đồng 63,4 – 64,5% với bộ gen của chủng gây bệnh Lelystad (chủng Châu Âu). Từ đó, Tian kegong cũng thấy các virus đã có sự đột biến ở một số axit amin.
Sergi Bruguera sau khi nghiên cứu về tác hại của bệnh PRRS và hiệu quả của vacxin Amervac - PRRS đã cho biết: ở đa số trại để giảm thiệt hại do bệnh gây ra thì lựa chọn tốt nhất là “sống chung với kẻ thù” tức tiêm vacxin phòng bệnh và quản lý chăm sóc nuôi dưỡng. Vacxin Amervac - PRRS là vacxin an toàn và hiệu quả cao với cả virus chủng Châu Âu và Bắc Mỹ, giúp kiểm soát bệnh PRRS rất tốt (Sergi Bruguera (2007), “Quyết định xử lý bệnh PRRS an toàn và hiệu quả với chương trình chủng ngừa bằng vacxin Amervac - PRRS, (Tài
liệu hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản và bệnh liên cầu khuẩn ở
lợn, Trường Đại học Nông nghiệp I – Hà Nội, tr 45-63).
2.2.2. Tại Việt Nam
Virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta năm 1997, trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dương tính với vi rút PRRS và cả đàn được tiêu hủy ngay. Tuy nhiên, theo điều tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virus PRRS (596/2.308 mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33%) nhiễm virus PRRS (Nguyễn Lương Hiền và cs, 2001). Một nghiên cứu khác cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm ở một trại chăn nuôi công nghiệp tại TP Hồ
Chí Minh là 5,97% (Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân, 2003). Năm 2003, tỷ lệ nhiễm bệnh PRRS trên lợn nuôi tập trung ở Cần Thơ là 66,86% (La Tấn Cường, 2005).
Năm 2007: Dịch bệnh PRRS xuất hiện tại 405 xã, thuộc 75 huyện của 21 tỉnh, thành phố. Tổng số gia súc mắc bệnh là 88.945 con, số chết và phải tiêu hủy là 19.217 con (Cục Thú y 2008), cụ thể:
Hình 2.6. Tình hình dịch bệnh PRRS ở Việt Nam (năm 2007)
Nguồn: http://www.cucthuy.gov.vn/
Theo báo cáo của Cục Thú y (2007), trong nhiều năm qua có một tỷ lệ nhất định lợn giống có huyết thanh dương tính với PRRS. Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất lớn đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn Việt Nam thực sự mới bắt đầu từ tháng 3/2007 (Hình 2.6)
+ Ngày 12/3/2007, dịch bệnh trên đàn lợn đầu tiên xuất hiện tại tỉnh Hải Dương. Sau đó, do không quản lý được việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh và phát triển mạnh tại 7 tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông
Hồng bao gồm: Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Phòng với 31.750 lợn mắc bệnh và số lợn chết lên tới 7.296 con. Sau hơn 1 tháng tích cực khống chế, dịch PRRS ở vùng này đã tạm thời được dập tắt.
+ Ngày 25/6/2007 dịch xuất hiện tại Quảng Nam, dịch bệnh đã lây sang Thừa Thiên Huế và Đà Nẵng với 33.433 con lợn mắc bệnh và 7.127 con chết.
+ Ngày 13/7/2007, tại tỉnh Long An, đã xác định có dịch bệnh PRRS với 91 lợn mắc bệnh và 8 con chết, địa phương đã tiêu huỷ 34 con. Điều này cho thấy bệnh đã xuất hiện ở đồng bằng sông Cửu Long (Hình 2.6).
Năm 2008: Từ cuối tháng 3 đến đầu tháng 7/2008 dịch xảy ra tại 17 tỉnh, thành phố.
+ Ngày 28/03/2008 dịch xuất hiện tại Thanh Hoá và Hà Tĩnh. Tỉnh Thanh Hoá có 193.003 lợn bị ốm, tiêu huỷ 192.946 con, Hà Tĩnh với 30.020 con bị ốm, tiêu huỷ 30.015 con. Riêng tỉnh Thanh Hoá chiếm 73% tổng số lợn ốm và tiêu huỷ trong cả đợt dịch trên toàn quốc.
+ Ngày 01/04/2008, tại Nghệ An đã xuất hiện dịch PRRS với 8.455 con mắc bệnh và tiêu huỷ 8.455 con.
+ Ngày 11/04/2008 dịch tái xuất hiện tại Thừa Thiên - Huế làm 16.389 lợn ốm, tiêu huỷ 16.389 con.
+ Ngày 14/04/2008 tại Thái Bình đã xác định có dịch và có 9.447 lợn mắc bệnh, tiêu huỷ 9.447 con.
+ Ngày 18/04/2008 dịch xuất hiện tại Nam Định với số lợn mắc bệnh là 4.784 con và có 4.768 con bị tiêu huỷ.
+ Trong tháng 4/2008 dịch xảy ở Thái Nguyên (17/04), Ninh Bình (19/04), Vĩnh Long (21/04).
+ Tháng 5 đến tháng 7/2008 dịch xảy ra ở các tỉnh: Bình Phước, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Lào Cai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Quảng Ninh.
Sau đợt dịch này, tổng số lợn ốm là 271.215 con, số tiêu huỷ là 261.854 con (Đậu Ngọc Hào và cs, 2008).
Năm 2009: năm 2009, dịch xảy ra ở 49 xã thuộc 14 huyện của 8 tỉnh, thành phố: Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 5.044 lợn mắc bệnh và 4.363 lợn buộc phải tiêu huỷ
(Cục Thú y., 2010).
Năm 2010: xảy ra 02 đợt dịch, đợt thứ nhất tại miền Bắc (Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La); Đợt thứ hai xảy ra tại một số tỉnh miền Nam (Sóc Trăng, Quảng Trị, Tiền Giang, Lào Cai, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phước, Đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, Đắk Lắk, Hậu Giang, Bà Rịa- Vùng Tàu, Lâm Đồng, Tây Ninh, Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Kiên Giang, Bến Tre, Cà Mau, KomTum, Đắc Nông, Gia Lai, Trà Vinh, Bình Thuận, Quảng Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên, Sơn La, Nam Định, Thanh Hóa, Hà Tĩnh) với 1.978 xã thuộc 286 huyện của 52 tỉnh, thành phố có dịch làm 1.114.166 con mắc bệnh và trong đàn có lợn bệnh; số chết, tiêu hủy là 438.699 con (Cục Thú y , 2011).
Nguyễn Lương Hiền và cs (2001) điều tra tình hình lợn mắc bệnh PRRS ở Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận, đã thấy 25% mẫu huyết thanh heo có kháng thể PRRS (596/2.308 mẫu) và 33% (5/15 trại) nhiễm PRRS.
Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2001) cho biết virus PRRS gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi. Người và các động vật khác không mắc bệnh nhưng loài vịt trời lại mẫn cảm với virus này. Virus PRRS có khả năng nhân lên trong cơ thể vịt trời làm cho mầm bệnh bị reo rắc trên diện rộng
Bùi Quang Anh và cs 2008 nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh PRRS đã kết luận: Lợn nái và lợn con theo mẹ bị mắc với tỷ lệ lớn. tỷ lệ chết của các loại lợn mắc PRRS khoảng 15 - 20%, cao hơn so với các nghiên cứu khác (Bùi Quang Anh và cs, 2008a).
Nghiên cứu về chỉ tiêu lâm sàng, chỉ tiêu máu ở lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên, Phạm ngọc Thạch, Đàm Văn Phải đã kết luận: Thời gian nung bệnh là 3 - 7 ngày, tần số hô hấp, tim mạch, thân nhiệt đều tăng cao so với sinh lý bình thường; Chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá máu đều thay đổi, đặc biệt là số lượng bạch cầu; Độ dự trữ kiềm trong máu tăng rất cao, trong khi đó hàm lượng đường huyết, protein tổng số của lợn bệnh lại giảm nhiều so với sinh lý bình thường. Đối với lợn nái, số lượng thai chết tỷ lệ thuận với tuổi thai lợn chửa dưới 2,5 tháng có tỷ lệ thai chết là 20%, lợn chửa trên 2,5 tháng có tỷ lệ thai chết
Lê Văn Năm (2007) bước đầu khảo sát các biểu hiện lâm sàng về bệnh tích đại thể bệnh PRRS tại một số địa phương thuộc Đồng Bằng Bắc Bộ đã thấy: các biểu hiện lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh PRRS trong đợt dịch năm 2007 trùng hợp với các tài liệu đã công bố. Tuy nhiên, tỷ lệ tiêu chảy chiếm 83,25%, khản tiếng 60,50% ở lợn con theo mẹ, táo bón ở lợn lớn chiếm 50,50%, cao hơn so với tài liệu đã công bố (Lê Văn Năm, 2007).
Nghiên cứu sự biến động kháng thể mẹ truyền cho con của nái nhiễm virus PRRS, Trần Thị Bích Liên và cs năm (2007) cho thấy: Hiệu giá kháng thể ở lợn con của nái dương tính với PRRS cao hơn của nái âm tính với PRRS. Tuy nhiên, lượng kháng thể giảm dần theo tuổi của lợn con và đến 60 ngày tuổi thì lợn con không còn kháng thể (Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân, 2003).
Năm 2012: dịch xảy ra tại 353 xã, phường của 74 quận, huyện thuộc 23 tỉnh, thành phố, với số lợn mắc bệnh trên 77 ngàn con, số lợn chết và buộc phải tiêu hủy gần 45 ngàn con...
Từ năm 2013 trở về đây dịch bênh PRRS đã được khống chế không thành dịch tuy nhiên vẫn xảy ra lẻ tẻ ở một vài địa phương
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài gồm 3 nội dung nghiên cứu:
- Tình hình chăn nuôi và dịch PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải Dương năm 2014.
- Một số đặc điểm dịch tễ của PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải Dương năm 2014.
- Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chung virus KTY-PRRS-07
3.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Tình hình chăn nuôi và dịch PRRS ở lợn tại Thanh Hà năm 2014
Vật liệu:
- Thu thập và phân tích số liệu: Số liệu điều tra về tình hình chăn nuôi lợn và tình hình dịch PRRS ở lợn được thu thập thông qua các tài liệu lưu trữ của Cục thống kê, Chi cục thú y, Trạm thú y (số liệu thứ cấp) về các chỉ tiêu:
Tổng số lợn (con) Số lợn mắc PRRS (con) Số lợn bị tiêu hủy (con)
Phương pháp nghiên cứu:
- Tiến hành dùng bảng hỏi (phiếu điều tra) để điều tra các hộ chăn nuôi; Kết hợp phỏng vấn sâu cán bộ thú y cơ sở để thu thập thêm thông tin.
3.2.2. Nghiên cứu đặc sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-07
Vật liệu:
Chủng virus KTY-PRRS-07 phân lập được tại Thái Bình năm 2014
Dụng cụ : Máy PCR , máy ly tâm, bộ điện di, buồng đếm Neubauer, tủ ấm, lò
vi sóng...
Hóa chất: DMEM, FBS, PBS, Trypsin − EDTA, DMSO, Agarose 1.2%...
Phương pháp nuôi cấy tế bào
Để chuẩn bị cho các bước nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lượng tế bào Marc-145 buồng đếm Neubauer cần thiết.
- “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FBS làm
ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FBS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường DMEM + 5% FBS.
Bước 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát
triển của tế bào. Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới.
- Cấy chuyển tế bào
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin − EDTA. Thêm 7 ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6 ml môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10 µl tế bào trong 990 µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1 ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong
môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6 ml/bình T25, 15 ml/bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. - Thu tế bào
Sau khi có đủ lượng tế bào cần thiết, tế bào được thu và bảo quản để tiếp tục sử dụng những lần khác. Mỗi tế bào thường có một giới hạn nhất định về số lần nuôi cấy, thực chất là số lần phân chia tế bào, trừ tế bào ung thư có khả năng
phân chia vô hạn. Vì thế, trong các lần cấy chuyển và thu hoạch cần ghi hồ sơ theo dõi tế bào để đảm bảo chất lượng tế bào cho nghiên cứu.
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi
trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1 ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -200C trong 2 −
3 giờ, chuyển sang -800C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
- Phương pháp đếm tế bào
Việc đếm tế bào được thực hiện trước khi nuôi cấy tế bào và xác định đường cong sinh trưởng của virus. Mật độ tế bào trước khi nuôi cấy tế bào có liên quan đến hiệu quả của quá trình nuôi cấy, nhất là nuôi cấy tế bào một lớp. Khi xây dựng đường cong sinh trưởng của virus, đếm tế bào là việc làm cần thiết để gây nhiễm virus theo một tỉ lệ thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi gây nhiễm virus ở MOI = 0,01, tức là theo tỉ lệ 1 virus/ 100 tế bào.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng buồng đếm Neubauer để đếm tế bào. Vị trí đếm áp dụng giống như đối với đếm hồng cầu. Đếm số lượng tế bào trong 5 ô đếm hồng cầu và tính theo phương pháp của Nguyễn Thị Lan và cs., 2005.
Phương pháp xác định hiệu giá virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2.0×104 tế bào/giếng).
Dịch nổi được hút bỏ và huyền phù virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp của các giếng theo thứ tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM có chứa 10% TBP được bổ sung vào (100µl/giếng)
CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm.
TCID50 được xác định theo phương pháp của Reed-Muench.
Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5x104 tế
bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên.
Virus PRRS phân lập được và chủng virus vacxin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0.01. Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus
được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0.5ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng.
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ dịch