4.3.1. Đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-07
Khả năng gây bệnh tích tế bào
Khi nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-07 chúng tôi tiến hành so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào với chủng virus JXA1. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.6.
Bảng 4.6. Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY-PRRS-07
STT Chủng virus Bệnh tích tế bào theo thời gian gây nhiễm virus (hpi)
12 24 36 48 60 72
1 KTY-PRRS-07 - 5 35 60 100 B
2 JXA1 - 10* 20 50 100 B
Ghi chú:
KTY-PRRS-07 là kí hiệu mẫu virus được lựa chọn nghiên cứu; JXA1 là kí hiệu của chủng virus được phân lập từ vắc xin thương mại. -: chưa quan sát thấy bệnh tích tế bào
B: Toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy
10*: 10% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy (ước lượng bằng mắt khi soi trên kính hiển vi soi nổi)
Qua bảng 4.6 ta thấy: sau 12 giờ gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-07chưa quan sát thấy bệnh tích tế bào, tới 24 giờ sau gây nhiễm 5% tế bào bị phá hủy so với
tổng diện tích đáy bình nuôi cấy, 36 giờ sau gây nhiễm 35% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy, 48 giờ sau gây nhiễm 60% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy, 60 giờ sau gây nhiễm 100% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy và 72 giờ sau gây nhiễm toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy.
Sau 12 giờ gây nhiễm chủng virus JXA1 chưa quan sát thấy bệnh tích tế bào, tới 24 giờ sau gây nhiễm 10% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy, 36 giờ sau gây nhiễm 25% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy, 48 giờ sau gây nhiễm 50% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy, 60 giờ sau gây nhiễm 100% tế bào bị phá hủy so với tổng diện tích đáy bình nuôi cấy và 72 giờ sau gây nhiễm toàn bộ tế bào bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy.
Hình 4.6. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm
Hình 4.8. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm
Hình 4.9. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm
Hiệu giá virus
2,25 x 106 TCID50/ml, hiệu giá cao
Quy luật nhân lên của virus
Hình 4.10. Quy luật nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-07
Khi gây nhiễm chủng virus KTY-PRRS-07 trong môi trường tế bào Marc145 thì thấy virus ở trong tế bào KTY-PRRS-07nhân lên tăng dần và đạt đỉnh điểm ở 48 giờ sau gây nhiễm, sau đó giảm dần tới 72 giờ sau gây nhiễm.
Virus ở dịch ngoài tế bào KTY-PRRS-07 nhân lên giảm dần từ 12 giờ tới 24 giờ sau gây nhiễm và sau đó tăng dần từ 24 giờ sau gây nhiễm và đạt đỉnh điểm ở 48 giờ sau gây nhiễm, sau đó quá trình nhân lên của virus giảm dần tới 72 giờ sau gây nhiễm.
Như vậy quá trình nhân lên của virus ở trong tế bào cao và ổn định hơn virus ở dịch ngoài tế bào.
4.3.2. Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-07
Sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR, sản phẩm được điện di trên thạch agarose 1,2%. Kết quả điện di thể hiện ở Hình 4.11.
- Thang chuẩn M 100bp
- Giếng từ 1, 2, 3 là mẫu dịch nuôi cấy tế bào.
- Giếng 4 là đối chứng dương (virus PRRS).
Hình 4.11. Kết quả phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 với dịch triết môi trường nuôi cấy tế bào(virus PRRS).
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm RT-PCR của chủng virus PRRS: KTY- PRRS-07 có kích thước khoảng 720pb và được hiển thị rõ trên thạch agarose 1,2%. Chứng tỏ toàn bộ quy trình phản ứng RT-PCR là chính xác từ việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu.
So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-07 với chủng virus JXA1 và chủng virus ATCC VR-2332
Thành phần nucleotide gen GP5 chủng virus KTY-PRS-07 chúng tôi nghiên cứu với gen tương ứng của các chủng PRRS trên thế giới được lựa chọn so sánh, thấy rằng:
- Đoạn gen GP5 chủng KTY-PRRS-07 có cùng độ dài với các chủng phân lập từ Trung Quốc và chủng Mỹ.
- Kết quả cho thấy có tất cả 71 vị trí sai khác về nucleotide giữa 3 chủng so sánh.
- Trình tự gen GP5 của chủng KTY-PRS-07 có 6 sai khác về thành phần
nucleotide so với JXA1 ở các vị trí: 434, 542(T↔C), 529 (A ↔ C), 409 (A ↔
G), 177 (A ↔ T), 511 (G ↔ C).
Qua đó cho thấy, sự sai khác nucleotide của gen GP5 ở chủng nghiên cứu: KTY-PRS-07 so với JXA1 chủng Trung Quốc là rất thấp, điều này chứng tỏ
chủng virus trên của Việt Nam rất có thể có nguồn gốc từ Trung Quốc.
Hình 4.12. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus ATCC VR-2332 và chủng virus
JXA1
Ghi chú: Sự sai khác về nucleotide của các mẫu được biểu thị bằng những nucleotide nằm ngoài đường giới hạn màu đỏ.
- Đối với chủng ATCC VR-2332 thuộc dòng Bắc Mỹ, có đến 66 sự sai khác so với chủng KTY-PRS-07 cụ thể như sau: 8, 12, 97, 168, 279, 324, 384,
481, 483, 498, 531(A ↔ G), 25, 304, 409, 411 (G ↔ T), 47, 86, 111, 121, 129,
231, 273, 322, 333, 348, 362, 369, 480, 495, 599 (C ↔ T), 71, 100, 104, 300, 339
(G ↔ A), 73, 183, 210, 249, 277, 281, 291, 358, 379, 390, 432, 474, 516, 542,
554, 600 (T ↔ C), 115, 174, 243 (C ↔ A), 117, 565, 588 (A ↔ T), 171, 302, 305
(T ↔ A), 172, 529 (A ↔ C), 197, 511 (G ↔ C), 216, 240 (T ↔ G), 275 (C ↔
G). Như vậy chủng KTY-PRS-07 của Việt Nam có mức độ thay đổi rất cao so với chủng ATCC VR-2332 đại diện đặc trưng PRRS của dòng Bắc Mỹ. Điều này phù hợp với nhận xét của các tác giả Trung Quốc khi phân tích gen và độc lực gây bệnh của PRRS xuất hiện năm 2006-2007 tại Trung Quốc (Tian K et al. , 2007) (Zhou Y.J et al. ,2008) (Feng Y, 2008).
Như vậy, về thành phần nucleotide, gen GP5 (ORF5) của chủng KTY-PRS- 07 phân lập tại Việt Nam có sự sai khác rất ít với gen tương ứng của các chủng phân lập từ Trung Quốc những năm 2006-2007, và so với gen tương ứng của chủng ATCC VR2332 (Bắc Mỹ) sự sai khác không lớn, trong khoảng cho phép của các chủng cùng genotype (Feng Y, 2008).
So sánh trình tự amino acid của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-07 với chủng virus JXA1 và chủng virus ATCC VR-2332
Hình 4.13. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gen ORF5 của chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus ATCC VR-2332 và chủng
virus JXA1 (vacxin)
Ghi chú: Sự sai khác về nucleotide của các mẫu được biểu thị bằng những amino acid nằm ngoài đường giới hạn màu đỏ.
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide, chúng tôi đã tiến hành so sánh thành phần amino acid tương ứng do gen GP5 này quy định mã hoá (sử dụng bộ mã của vi khuẩn bậc thấp-bacterial code, có trong Ngân hàng gen). Kết quả so sánh thành phần amino acid được trình bày ở Hình 4.13.
Những sai khác về nucleotide của bộ ba mã hoá có thể dẫn đến những sai khác về thành phần amino acid (vị trí nucleotide thứ nhất trong bộ ba mã hoá), nhưng cũng có thay đổi về nucleotide mà ít dẫn đến thay đổi về amino acid, do một số amino acid có thể do nhiều bộ ba mã hoá. Kết quả ở Hình 4.13 cho thấy, có tất cả 71 vị trí sai khác về nucleotide nhưng chỉ làm thay đổi 30 vị trí amino acid.
Kết quả ở Hình 4.13 cho thấy:
- Chuỗi polypeptide do gen GP5 KTY-PRS-07 quy định mã hoá cho 200 amino acid bằng số amino acid của các chủng JAX1 phân lập từ Trung Quốc và ATCC VR-2332 chủng thuộc dòng Bắc Mỹ.
- Có sự sai khác rất ít về amino acid của chuỗi polypeptid GP5 chủng
KTY-PRS-07 và JAX1: cụ thể có 6 vị trí sai khác: 33 (N ↔ D), 59 (K ↔ N), 145
(N ↔ P), 164 (G ↔ R), 177 ( R ↔ Q), 181 (L ↔ P).
- Trong khi đó, sự sai khác của chuỗi polypeptide GP5 của KTY-PRRS-07 với chủng ATCC VR-2332 (dòng Bắc Mỹ) lại cao hơn nhiều, có 29 vị trí sai khác: 3, 9, 16, 24, 25, 29, 33, 34, 35, 39, 58, 59, 65, 91, 93, 100, 101, 121, 127, 137, 145, 161, 171, 177, 181, 185, 189, 196, 200.
Như vậy, kết quả phân tích so sánh về thành phần amino acid của chuỗi polypeptide GP5 ở trên cũng cho thấy, chủng KTY-PRRS-07 của Thanh Hà có sự sai khác rất ít so với các chủng của Trung Quốc và có sự khác biệt so với chủng ATCC VR-2332. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích so sánh về thành phần nucleotide của gen GP5 ở trên.
Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ nguồn gốc phát sinh loài
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid giữa các chủng virus PRRS chúng tôi tiến hành lập sơ đồ phả hệ dựa trên sự phân tích so sánh về thành phần nucleotide và amino acid của chuỗi gen GP5 nghiên cứu, sử dụng chương trình MEGA3.1. Kết quả được trình bày ở hình 4.14
LC102499/Vietnam/2015/KTY PRRS 01 KTY-PRRS-07 LC102501/Vietnam/2015/KTY PRRS 03 KU556995/China/2014/HENHB1 JN642707/China/2010/SHZ-2010 KC263023/China/2011/HUAY2-11 EF112445/China/2006/JXA1 KP771739/China/2014/NVDC-SC1-2014 AB856283/Vietnam/2011/HUA-Viet.labPRRS1 LC102500/Vietnam/2015/KTY PRRS 02 JQ860372/Vietnam/2009/DN292 JQ860375/Vietnam/2010/DN1 KM244763/Vietnam/2013/MN1 FJ895329/China/SX2009 JQ860362/Vietnam/2008/DN444 AB856287/Vietnam/2013/HUA-Vet.lab PRRS5 AB856285/Vietnam/2012/HUA-Vet.lab PRRS3 JQ860389/Vietnam/2012/DT9 FJ536165/China/2004/NB/04 AY032626/China/1995/CH-1a Sublineage 8.7 Sublineage 8.5 AY656993/USA/2005/SDSU73 Sublineage 8.9 EF532801/USA/2004/INGELVAC ATP Sublineage 8.1 AF176476/USA/2000/PRRSV55 Sublineage 8.3 AF339494/USA/2001/98-31701-1 Lineage 8 Lineage 9 EU556160/USA/2008/2000-5424 Lineage 6 U66380/USA/1996/34075-NE U87392/USA/1990/ATCC VR-2332 GU187014/Singapore/2009/BCL-PS 100 Lineage 5 Lineage 7 DQ779791/USA/1998/Prime-Pac Lineage 4 AB546105/Japan/2008/Miyagi08-2 Lineage 3 AF121131/Taiwan/1997/MD-001 Lineage 2 EU758940/USA/2007/PRRSV0000008973 Lineage 1 AY297118/Thailand/2002/02SP3 PRRSV type I
M96262/Netherlands/1991/Lelystad virus EU-type
96 47 39 7 27 8 11 19 22 34 10 79 99 61 64 93 99 59 65 63 84 67 60 0.2
Hình 4.14. Cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ nguồn gốc phát sinh loài
Ghi chú:
Chủng virus KTY-PRRS-07 Chủng virus vắc-xin
Chủng KTY-PRRS-07 nằm trong cùng nhánh phát sinh với chủng KTY- PRRS-01, KTY-PRRS-03 phân lập tại Việt Nam (2015); và chủng SHZ-2010; HUAY2-11; HENHB1 phân lập tại Trung Quốc năm 2010, 2011 và 2014.
Kết quả xây dựng cây sinh học cho thấy chủng KTY-PRRS-07 phân lập nằm cùng nhánh với chủng virus SX-2009 cường độc phân lập tại Trung Quốc và nằm cùng trong nhánh phát sinh với chủng virus JXA1 hiện đang được sử dụng ở nước ta. Điều này cho thấy hiệu quả của vacxin JXA1 trong việc phòng bệnh hiện nay.
Chủng KTY-PRRS-07 nằm trong sublineage 8.7 thuộc lineage 8. Chủng KTY-PRRS-07 nằm khác nhánh phát sinh với các lineage khác như: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 thuộc nhánh phát sinh của chủng Bắc Mỹ. Chủng KTY-PRRS-07 nằm khác xa với nhánh phát sinh của chủng virus Lelystad (Châu Âu).
4.4. MỘT SỐ GIẢI PHÁP PHÒNG, CHỐNG DỊCH BỆNH PRRS THỰC TẾ CỦA THANH HÀ TẾ CỦA THANH HÀ
Ngành chăn nuôi Thanh Hà đã và đang áp dụng chăn nuôi theo quy trình VietGAP, Chăn nuôi an toàn sinh học nhằm ngăn ngừa và hạn chế sự lây nhiễm của các tác nhân sinh học xuất hiện tự nhiên hoặc do con người tạo ra gây hại đến con người, gia súc và hệ sinh thái và tạo ra nguồn sản phẩm nhiều, chất lượng tốt để đáp ưng nhu cầu của con người.
Quyết tâm thực hiện tốt 4 mục tiêu và 3 nguyên tắc sau:
4 mục tiêu
- Ngăn cản sự lây lan mầm bệnh từ trong trại (nếu có) ra ngoài trại.
- Ngăn cản sự xâm nhập của mầm bệnh từ bên ngoài trại vào trong trại.
- Không để gia súc, gia cầm trong trại phát bệnh
- Không để mầm bệnh lây lan giữa các khu vực trong trại.
3 nguyên tắc cơ bản:
- Nguyên tắc thứ nhất: kiểm soát mọi thứ ra vào khu vực chăn nuôi.
Phòng chống bệnh PRRS là nhiệm vụ của các cấp, các ngành, cơ quan thú y có trách nhiệm theo dõi, giám sát dịch bệnh, phân tích đánh giá các yếu tố nguy cơ về dịch bệnh, tham mưu cho chính quyền các cấp kế hoạch, phương án phòng chống dịch bệnh hiệu quả. Chính quyền các cấp đóng vai trò quyết định trong
việc tổ chức thực hiện thành công chương trình phòng chống bệnh.
- Nguyên tắc thứ hai: giữ cho đàn vật nuôi trong điều kiện vệ sinh thú y
tốt nhất.
- Nguyên tắc thứ ba: giữ cho đàn vật nuôi trong quần thể, môi trường được
bảo vệ.
4.4.1. Các giải pháp hành chính
- Xử lý kịp thời các thông tin tình hình dịch bệnh PRRS của các tỉnh trong cả nước, đặc biệt là các tỉnh lân cận.
- Tuyên truyền, phổ biến kiến thức về bệnh PRRS, nâng cao ý thức của người dân về công tác phòng chống bệnh. Tổ chức hội nghị, tập huấn về các biện pháp phòng chống bệnh cho cán bộ chính quyền các cấp và thú y xã, phường, người chăn nuôi, buôn bán và giết mổ gia súc.
- Phối hợp tốt với Uỷ ban nhân dân cấp huyện, xã, phường tổ chức lực lượng mà trong đó thú y là nòng cốt, phối hợp với các ngành (công an, quản lý thị trường...) để triển khai công tác kiểm dịch động vật, kiểm soát giết mổ gia súc, kiểm tra vệ sinh thú y các sản phẩm động vật.
4.4.2. Các giải pháp chuyên môn
- Thành lập quỹ phòng chống dịch bệnh đồng thời chuẩn bị cơ sở vật chất kỹ thuật để bao vây, khống chế, tiêu diệt mầm bệnh tại chỗ khi dịch PRRS mới được phát hiện.
- Cần xây dựng, đào tạo đội ngũ cán bộ thú y đáp ứng nhu cầu về kiến thức quản lý nhà nước, chuyên môn nghiệp vụ, nhất là kiến thức dịch tễ học.
- Kiện toàn mạng lưới thú y xã, phường, duy trì hoạt động một cách đồng bộ, có hiệu quả.
- Thực hiện nghiêm việc tiêm vacxin phòng bệnh. Quản lý chặt chẽ công tác tiêm phòng đồng thời xử lý nghiêm các trường hợp vi phạm theo Nghị định 119/2013/NĐ-CP ngày 09/10/2013 của Chính phủ.
4.4.3. Các biện pháp kỹ thuật
- Thực hiện quản lý chặt chẽ hoạt động vận chuyển, buôn bán, giết mổ gia súc. Đây là khâu quan trọng trong kiểm soát việc tuân thủ các quy định về phòng, chống dịch của người chăn nuôi. Giảm nguy cơ lây lan dịch bệnh qua vận chuyển, mua bán và giết mổ gia súc.
- Điều tra dịch tễ, xây dựng bản đồ dịch tễ của địa phương, có kế hoạch xây dựng, kiểm soát hiệu quả các vùng an toàn dịch bệnh.
- Chú trọng trong công tác chẩn đoán lâm sàng, lấy mẫu gửi đi xét nghiệm kịp thơì, đồng thời lập kế hoạch giám sát chủ động để đánh giá nguy cơ, xá định chủng virus để chủ động chiến lược tiêm phòng vacxin PRRS thích hợp, hiệu quả.
- Kiểm tra giám sát chặt chẽ việc vận chuyển, buôn bán gia súc, đặc biệt là gia súc làm giống phải được giám sát và theo dõi cách ly, có liên hệ chặt chẽ với các tỉnh khác để giám sát, theo dõi nhập, xuất gia súc. Phối hợp chặt chẽ với bộ đội biên phòng, hải quan, chính quyền và nhân dân các xã biên giới phát hiện, xử lý nghiêm các trường hợp nhập lậu động vật và sản phẩm vật từ nước ngoài vào