Sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR, sản phẩm được điện di trên thạch agarose 1,2%. Kết quả điện di thể hiện ở Hình 4.11.
- Thang chuẩn M 100bp
- Giếng từ 1, 2, 3 là mẫu dịch nuôi cấy tế bào.
- Giếng 4 là đối chứng dương (virus PRRS).
Hình 4.11. Kết quả phản ứng RT – PCR với mồi ORF5 với dịch triết môi trường nuôi cấy tế bào(virus PRRS).
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm RT-PCR của chủng virus PRRS: KTY- PRRS-07 có kích thước khoảng 720pb và được hiển thị rõ trên thạch agarose 1,2%. Chứng tỏ toàn bộ quy trình phản ứng RT-PCR là chính xác từ việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu.
So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-07 với chủng virus JXA1 và chủng virus ATCC VR-2332
Thành phần nucleotide gen GP5 chủng virus KTY-PRS-07 chúng tôi nghiên cứu với gen tương ứng của các chủng PRRS trên thế giới được lựa chọn so sánh, thấy rằng:
- Đoạn gen GP5 chủng KTY-PRRS-07 có cùng độ dài với các chủng phân lập từ Trung Quốc và chủng Mỹ.
- Kết quả cho thấy có tất cả 71 vị trí sai khác về nucleotide giữa 3 chủng so sánh.
- Trình tự gen GP5 của chủng KTY-PRS-07 có 6 sai khác về thành phần
nucleotide so với JXA1 ở các vị trí: 434, 542(T↔C), 529 (A ↔ C), 409 (A ↔
G), 177 (A ↔ T), 511 (G ↔ C).
Qua đó cho thấy, sự sai khác nucleotide của gen GP5 ở chủng nghiên cứu: KTY-PRS-07 so với JXA1 chủng Trung Quốc là rất thấp, điều này chứng tỏ
chủng virus trên của Việt Nam rất có thể có nguồn gốc từ Trung Quốc.
Hình 4.12. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus ATCC VR-2332 và chủng virus
JXA1
Ghi chú: Sự sai khác về nucleotide của các mẫu được biểu thị bằng những nucleotide nằm ngoài đường giới hạn màu đỏ.
- Đối với chủng ATCC VR-2332 thuộc dòng Bắc Mỹ, có đến 66 sự sai khác so với chủng KTY-PRS-07 cụ thể như sau: 8, 12, 97, 168, 279, 324, 384,
481, 483, 498, 531(A ↔ G), 25, 304, 409, 411 (G ↔ T), 47, 86, 111, 121, 129,
231, 273, 322, 333, 348, 362, 369, 480, 495, 599 (C ↔ T), 71, 100, 104, 300, 339
(G ↔ A), 73, 183, 210, 249, 277, 281, 291, 358, 379, 390, 432, 474, 516, 542,
554, 600 (T ↔ C), 115, 174, 243 (C ↔ A), 117, 565, 588 (A ↔ T), 171, 302, 305
(T ↔ A), 172, 529 (A ↔ C), 197, 511 (G ↔ C), 216, 240 (T ↔ G), 275 (C ↔
G). Như vậy chủng KTY-PRS-07 của Việt Nam có mức độ thay đổi rất cao so với chủng ATCC VR-2332 đại diện đặc trưng PRRS của dòng Bắc Mỹ. Điều này phù hợp với nhận xét của các tác giả Trung Quốc khi phân tích gen và độc lực gây bệnh của PRRS xuất hiện năm 2006-2007 tại Trung Quốc (Tian K et al. , 2007) (Zhou Y.J et al. ,2008) (Feng Y, 2008).
Như vậy, về thành phần nucleotide, gen GP5 (ORF5) của chủng KTY-PRS- 07 phân lập tại Việt Nam có sự sai khác rất ít với gen tương ứng của các chủng phân lập từ Trung Quốc những năm 2006-2007, và so với gen tương ứng của chủng ATCC VR2332 (Bắc Mỹ) sự sai khác không lớn, trong khoảng cho phép của các chủng cùng genotype (Feng Y, 2008).
So sánh trình tự amino acid của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY- PRRS-07 với chủng virus JXA1 và chủng virus ATCC VR-2332
Hình 4.13. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gen ORF5 của chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus ATCC VR-2332 và chủng
virus JXA1 (vacxin)
Ghi chú: Sự sai khác về nucleotide của các mẫu được biểu thị bằng những amino acid nằm ngoài đường giới hạn màu đỏ.
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide, chúng tôi đã tiến hành so sánh thành phần amino acid tương ứng do gen GP5 này quy định mã hoá (sử dụng bộ mã của vi khuẩn bậc thấp-bacterial code, có trong Ngân hàng gen). Kết quả so sánh thành phần amino acid được trình bày ở Hình 4.13.
Những sai khác về nucleotide của bộ ba mã hoá có thể dẫn đến những sai khác về thành phần amino acid (vị trí nucleotide thứ nhất trong bộ ba mã hoá), nhưng cũng có thay đổi về nucleotide mà ít dẫn đến thay đổi về amino acid, do một số amino acid có thể do nhiều bộ ba mã hoá. Kết quả ở Hình 4.13 cho thấy, có tất cả 71 vị trí sai khác về nucleotide nhưng chỉ làm thay đổi 30 vị trí amino acid.
Kết quả ở Hình 4.13 cho thấy:
- Chuỗi polypeptide do gen GP5 KTY-PRS-07 quy định mã hoá cho 200 amino acid bằng số amino acid của các chủng JAX1 phân lập từ Trung Quốc và ATCC VR-2332 chủng thuộc dòng Bắc Mỹ.
- Có sự sai khác rất ít về amino acid của chuỗi polypeptid GP5 chủng
KTY-PRS-07 và JAX1: cụ thể có 6 vị trí sai khác: 33 (N ↔ D), 59 (K ↔ N), 145
(N ↔ P), 164 (G ↔ R), 177 ( R ↔ Q), 181 (L ↔ P).
- Trong khi đó, sự sai khác của chuỗi polypeptide GP5 của KTY-PRRS-07 với chủng ATCC VR-2332 (dòng Bắc Mỹ) lại cao hơn nhiều, có 29 vị trí sai khác: 3, 9, 16, 24, 25, 29, 33, 34, 35, 39, 58, 59, 65, 91, 93, 100, 101, 121, 127, 137, 145, 161, 171, 177, 181, 185, 189, 196, 200.
Như vậy, kết quả phân tích so sánh về thành phần amino acid của chuỗi polypeptide GP5 ở trên cũng cho thấy, chủng KTY-PRRS-07 của Thanh Hà có sự sai khác rất ít so với các chủng của Trung Quốc và có sự khác biệt so với chủng ATCC VR-2332. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích so sánh về thành phần nucleotide của gen GP5 ở trên.
Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ nguồn gốc phát sinh loài
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid giữa các chủng virus PRRS chúng tôi tiến hành lập sơ đồ phả hệ dựa trên sự phân tích so sánh về thành phần nucleotide và amino acid của chuỗi gen GP5 nghiên cứu, sử dụng chương trình MEGA3.1. Kết quả được trình bày ở hình 4.14
LC102499/Vietnam/2015/KTY PRRS 01 KTY-PRRS-07 LC102501/Vietnam/2015/KTY PRRS 03 KU556995/China/2014/HENHB1 JN642707/China/2010/SHZ-2010 KC263023/China/2011/HUAY2-11 EF112445/China/2006/JXA1 KP771739/China/2014/NVDC-SC1-2014 AB856283/Vietnam/2011/HUA-Viet.labPRRS1 LC102500/Vietnam/2015/KTY PRRS 02 JQ860372/Vietnam/2009/DN292 JQ860375/Vietnam/2010/DN1 KM244763/Vietnam/2013/MN1 FJ895329/China/SX2009 JQ860362/Vietnam/2008/DN444 AB856287/Vietnam/2013/HUA-Vet.lab PRRS5 AB856285/Vietnam/2012/HUA-Vet.lab PRRS3 JQ860389/Vietnam/2012/DT9 FJ536165/China/2004/NB/04 AY032626/China/1995/CH-1a Sublineage 8.7 Sublineage 8.5 AY656993/USA/2005/SDSU73 Sublineage 8.9 EF532801/USA/2004/INGELVAC ATP Sublineage 8.1 AF176476/USA/2000/PRRSV55 Sublineage 8.3 AF339494/USA/2001/98-31701-1 Lineage 8 Lineage 9 EU556160/USA/2008/2000-5424 Lineage 6 U66380/USA/1996/34075-NE U87392/USA/1990/ATCC VR-2332 GU187014/Singapore/2009/BCL-PS 100 Lineage 5 Lineage 7 DQ779791/USA/1998/Prime-Pac Lineage 4 AB546105/Japan/2008/Miyagi08-2 Lineage 3 AF121131/Taiwan/1997/MD-001 Lineage 2 EU758940/USA/2007/PRRSV0000008973 Lineage 1 AY297118/Thailand/2002/02SP3 PRRSV type I
M96262/Netherlands/1991/Lelystad virus EU-type
96 47 39 7 27 8 11 19 22 34 10 79 99 61 64 93 99 59 65 63 84 67 60 0.2
Hình 4.14. Cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ nguồn gốc phát sinh loài
Ghi chú:
Chủng virus KTY-PRRS-07 Chủng virus vắc-xin
Chủng KTY-PRRS-07 nằm trong cùng nhánh phát sinh với chủng KTY- PRRS-01, KTY-PRRS-03 phân lập tại Việt Nam (2015); và chủng SHZ-2010; HUAY2-11; HENHB1 phân lập tại Trung Quốc năm 2010, 2011 và 2014.
Kết quả xây dựng cây sinh học cho thấy chủng KTY-PRRS-07 phân lập nằm cùng nhánh với chủng virus SX-2009 cường độc phân lập tại Trung Quốc và nằm cùng trong nhánh phát sinh với chủng virus JXA1 hiện đang được sử dụng ở nước ta. Điều này cho thấy hiệu quả của vacxin JXA1 trong việc phòng bệnh hiện nay.
Chủng KTY-PRRS-07 nằm trong sublineage 8.7 thuộc lineage 8. Chủng KTY-PRRS-07 nằm khác nhánh phát sinh với các lineage khác như: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 thuộc nhánh phát sinh của chủng Bắc Mỹ. Chủng KTY-PRRS-07 nằm khác xa với nhánh phát sinh của chủng virus Lelystad (Châu Âu).