chín muộn
- Thu thập, phân lập các chủng vi sinh vật gây bệnh cho bọ xít từ các vùng trồng nhãn chín muộn tập trung ở Hà Nội.
- Đánh giá, tuyển chọn các chủng VSV có hiệu lực cao trong hạn chế bọ xít hại nhãn chín muộn.
- Nghiên cứu tạo nguồn chủng thuần và kỹ thuật bảo quản duy trì bộ giống vi sinh vật thuần khiết.
Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bọ xít hại nhãn chín muộn
Nghiên cứu xác định điều kiện sinh trưởng, phát triển sinh khối thích hợp nhất đối với các chủng VSV đã lựa chọn.
Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật sử dụng chế phẩm để phòng chống bọ xít hại nhãn chín muộn
- Khảo nghiệm, đánh giá hiệu quả phòng trừ bọ xít hại nhãn của chế phẩm trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, ngoài đồng ruộng (diện hẹp).
- Nghiên cứu phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học: nghiên cứu liều lượng, thời điểm, số lần phun thích hợp.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Thu thập, phân lập và tuyển chọn bộ giống vi sinh vật (VSV) ký sinh bọ xít hại nhãn bọ xít hại nhãn
3.5.1.1. Phương pháp thu thập các vi sinh vật gây bệnh cho bọ xít
Điều tra thu thập các nguồn vi sinh vật ký sinh gây chết bọ xít ngoài tự nhiên tại 3 khu vực trồng nhãn chín muộn tập trung của Hà Nội. Đó là các vùng ven sông Đáy trực thuộc các huyện Hoài Đức, Quốc Oai, Chương Mỹ và các vùng lân cận. Mỗi khu vực chọn 3 vườn đại diện được tính đa dạng của sản xuất của khu vực đó. Tại mỗi vườn chọn 5 điểm, mỗi điểm chọn cây có mật độ
bọ xít cao, thu bắt các thể bọ xít chết. Xác định các mẫu bọ xít bị nấm ký sinh bằng phương pháp quan sát ban đầu theo triệu chứng của vi sinh vật ký sinh côn trùng như: Bề mặt có lớp bào tử, côn trùng ký chủ bị triệu chứng chết cứng… Mẫu vật thu thập được bảo quản riêng trong các ống túyp có nút bông đã được khử trùng sau đó đem về phòng thí nghiệm để phân lập và giám định mẫu.
3.5.1.2. Phương pháp phân lập các chủng VSV ký sinh trên bọ xít
Tiến hành phân lập nấm theo phương pháp của Barnett và Hunter (1972). Khử trùng bề mẫu bọ xít bằng dung dịch cồn 50% trong 30 giây, sau đó nghiền mẫu trong cối sứ, thêm 1 đến 5 ml nước vô trùng, dùng micro pipet hút 0,1 ml cho vào đĩa môi trường PDA và dùng trang thủy tinh trang kín bề mặt.
3.5.1.3. Phương pháp tuyển chọn và đánh giá chủng nấm có hiệu lực cao trong phòng trừ bọ xít hại nhãn
- Đánh giá tuyển chọn chủng nấm có hiệu lực cao trong phòng trừ bọ xít trong điều kiện phòng thí nghiệm của Trung tâm Đấu tranh sinh học (Viện Bảo vệ thực vật) theo phương pháp phun trực tiếp dung dịch bào tử nấm lên cá thể bọ xít tuổi 2.
- Thí nghiệm được bố trí với 8 công thức tương ứng với 8 chủng nấm lây nhiễm vào bọ xít non là BX1, BX2, BX3, BX4, BX5, BX6, BX7, BX8 và công thức đối chứng (phun nước lã). Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại lây nhiễm trên 30 cá thể bọ xít tuổi 2, được đặt trong pocan. Nồng độ bảo tử nấm lây nhiễm là 5,0×109 Cfu/ml.
- Chỉ tiêu theo dõi: số bọ xít chết sau 7, 10 ngày lây nhiễm nấm.
- Hiệu lực ký sinh gây chết bọ xít của các chủng nấm được tính theo công thức Abbott.
3.5.1.4. Giám định chủng VSV có hoạt tính sinh học cao trong phòng chống hiệu quả bọ xít hại nhãn
Chủng vi sinh vật có tiềm năng được tiến hành giám định dựa trên các đặc điểm hình thái của nấm kết hợp giám định bằng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen vùng ITS.
- Giám định bằng hình thái: Sau khi nuôi cấy chủng nấm trên môi trường
PDA sau 5 ngày, tiến hành lấy các mẫu cành bào tử để soi trên kính hiển vi để giám định loài.
Tách chiết ADN
Lấy 1 vòng que cấy khuẩn ty vào ống eppendorf vô trùng, thêm 500 µl 2×SSC vào mỗi ống. Lắc đều và giữ ở 99 oC trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nước cất vô trùng. Thêm khoảng 100 µl hạt thủy tinh có đường kính 0,2 - 0,5 mm (Roth, Đức), 100 µl dung dịch phenol/chloroform (tỉ lệ 1:1) và 100 µl nước cất vô trùng. Lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút trên máy Thermocomfort (Eppendorf, Đức) sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN sau khi tách chiết được giữ ở -20 oC.
Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự
Phân đoạn rADN của vi sinh vật được khuyếch đại bằng mồi ITS1, NL4 trên thiết bị GeneAmp® PCRSystem 9700 (PE Applied Biosystem, Mỹ) với chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 94 oC trong 2 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (94 oC trong 30 giây, 52 oC trong 30 giây và 72 oC trong 1 phút).
Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72 oC trong 7 phút và sau đó sản phẩm
PCR được bảo quản ở 10 oC.
Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được tinh chế bằng QIAEX II (Qiagen, Đức) theo khuyến cáo của hãng. Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide - nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ. Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999) và so sánh bằng ClustalX (Thompson et al., 1997).
Danh sách các mồi sử dụng trong phân loại
ITS1 5’ to 3’: TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4 5’ to 3’: GGTCCGTGTTTCAAGACGG
3.5.1.5. Phương pháp nghiên cứu tạo nguồn chủng thuần và kỹ thuật bảo quản duy trì bộ giống vi sinh vật thuần khiết
nước cất vô trùng ở nồng độ 103 - 105. Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường
trong đĩa petri có chứa môi trường PDA. Nhúng chang thuỷ tinh vào cồn 70o, hơ
qua ngọn lửa để khử trùng. Để chang thủy tinh nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng chang thủy tinh lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu chang gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch.
Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho chang thủy tinh trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường. Rút chang thủy tinh khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm. Sau khoảng 12 - 24 giờ tiến hành soi đĩa nấm đó bằng kính lúp để bàn để quan sát bào tử nấm nảy mầm. Khi thấy bào tử nảy mầm, dùng que cấy có đầu nhọn hình lưỡi mác cắt riêng phần thạch chứa bào tử đó cấy sang đĩa môi trường khác, sau đó để đĩa có chứa đơn bào tử đó trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3-5 ngày bào tử phát triển thành tản nấm tiến hành cấy truyền vào tuýp môi trường thu được chủng vi sinh vật thuần khiết.
Phương pháp bảo quản các chủng giống gốc:
Cấy các chủng giống gốc trong ống môi trường PDA và để ở 25 oC trong 7
ngày để các chủng nấm hình thành bào tử. Mỗi công thức cho mỗi chủng cấy 100 ống. Sau đó tiến hành bảo quản bằng 3 phương pháp tương ứng 3 công thức:
CT1: Bảo quản ống thạch nghiêng bằng phương pháp thông thường: Các ống giống sẽ được đặt trong điều kiện tủ lạnh 4 oC
CT2: Bảo quản bằng ống thạch nghiêng + glyceryl: Đổ dung dịch glyceryl 5% ngập hết bề mặt của ống giống nấm đã cấy, sau đó đặt trong điều kiện 4 oC.
CT3: Bảo quản bằng phương pháp bào tử nấm + Glycerol 10% bảo quản ở điều kiện -20 oC.
Sau thời gian bảo quản, 3 tháng 1 lần lấy giống ra và pha loãng ở nồng độ 10-5 và cấy lại trên môi trường, sau 5 ngày đếm số bào tử mọc mầm.
Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử nấm nảy mầm
Phương pháp đếm bào tử: Dùng buồng đếm hồng cầu và được tiến hành như sau: Nghiền 1 cm2 tản nấm vào 10 ml nước cất và lắc đều, lấy 1 ml dịch bào tử vừa pha cho vào 9 ml nước cất, cứ hòa như vậy với tỷ lệ 1 ml dịch bào tử với 9 ml nước cất cho đến khi đếm được bào tử (10-4 – 10-6).