- Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh âm sâu 800C, tủ lạnh âm 300C, nồi hấp ướt, tủ sấy, máy gây nhũ, máy ấp trứng, tủ ấm lắc.
- Đèn soi trứng, giá đựng ống nghiệm, bút chì, kim tiêm.
- Các dụng cụ thí nghiệm khác dùng trong nghiên cứu vi rút: Dùi đục trứng, Seringe, ống nghiệm, hộp lồng, bình tam giác, kéo, panh, kẹp (tất cả được rửa sạch, sấy khô ở 1210
C/30 phút)
- Máy ly tâm thường, máy trộn Ultra -Turrax T25, tủ ấm, tủ lạnh.
- Phòng thí nghiệm ATSH tại Công Ty Cổ Phần Thuốc Thú Y Trung Ương 5.
- Phòng nuôi động vật ATSH tại Công Ty Cổ Phần Thuốc Thú Y Trung Ương 5.
3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Tiêm vào xoang niệu mô
Chọn trứng vịt có phôi 10 - 11 ngày tuổi từ những vịt mẹ chưa được tiêm chủng EDS và không mắc bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng, hình dạng trứng đồng đều.
Soi trứng đánh dấu buồng hơi và vị trí tiêm cách xa đầu phôi và mạch máu lớn. Đặt trứng lên giá trứng, sát trùng bằng cồn 700, sau đó sát trùng bằng cồn iod 10% vào đầu buồng hơi và vị trí tiêm. Lấy dùi chọc thủng một lỗ ở vị trí tiêm, dùng ống tiêm nhỏ loại 1 ml đâm kim thẳng góc với quả trứng, rồi bơm huyễn dịch vi rút theo các nồng độ được pha loãng theo quy định của từng thí nghiệm vào xoang niệu. Sau đó dùng parafin lỏng gắn kín lỗ tiêm lại, để trứng nằm lên khay trứng cho vào tủ ấm 370C, duy trì độ ẩm 62%.
3.3.2. Phƣơng pháp nhân vi rút trên trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi
Bước 1: Chuẩn bị trứng
Trứng vịt có nguồn gốc từ đàn vịt sạch bệnh, được lau sạch bằng vải thấm nước sạch và nước sát trùng. Toàn bộ trứng và khay chứa trứng được làm khô tự nhiên và chuyển vào buồng tiệt trùng bằng biện pháp xông Formol. Trứng được chuyển vào máy ấp trứng tự động ấp ở nhiệt độ 37 - 38,50C, độ ẩm 60%.
Sau 5 ngày, soi loại thải những trứng không có phôi và phôi phát triển yếu. Sau 10 ngày, soi thải những trứng chết phôi, phôi phát triển yếu và đánh dấu xác định vị trí buồng hơi và đầu thai.
Giống vi rút EDS được pha loãng bằng dung dịch PBSvô trùng (pH = 7,0 - 7,2 có bổ sung kháng sinh và kháng nấm) tương đương với liều gây nhiễm thích hợp.
Lấy mẫu kiểm tra vô trùng và hiệu giá ngưng kết hồng cầu của huyễn dịch vi rút giống đã pha.
Bước 3: Gây nhiễm vi rút
Tiêm vào xoang niệu nang của mỗi phôi 0,2 ml huyễn dịch vi rút giống đã pha, hàn kín vị trí tiêm và đưa vào ấp tiếp ở nhiệt độ 370C.
Trứng sau khi tiêm được ấp tiếp trong tủ ấp ở nhiệt độ 370C. Hàng ngày theo dõi sự phát triển của phôi. Những phôi chết trước 24 giờ sau gây nhiễm loại thải. Những phôi chết từ 30 - 48 giờ được bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C, chờ thu hoạch.
Bước 4: Thu hoạch dịch niệu nang
Sát trùng kỹ khu vực buồng hơi bằng cồn 700, cồn Iode 1%. Sau đó dùng panh, kéo bộc lộ buồng hơi, màng cứng và thu hoạch dịch niệu nang.
Dịch niệu nang được tập trung vào các chai đã vô trùng,
Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/ phút trong thời gian 10 phút ở 40C, thu hoạch dịch trong bên trên (loại bỏ lắng cặn).
Lấy mẫu kiểm tra vô trùng theo mục 3.3.5 và hiệu giá ngưng kết hồng cầu theo mục 3.3.3.
Huyễn dịch vi rút bán thành phẩm bảo quản -300C.
3.3.3. Phƣơng pháp làm HA, HI Phƣơng pháp HA
Cách tiến hành: Sẽ tiến hành phản ứng trên đĩa 96 giếng đáy hình chữ U.
Bước 1: Pha loãng kháng nguyên
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ½ 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 HC B ½ 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 HC
Chia đều50µl PBS vào giếng A1-12, B1-12. Thêm 50µl kháng nguyên EDS vào giếng A1, B1.
Trộn đều, chuyển 50µl sang giếng A2, B2. Tiếp tục trộn đều và chuyển 50µl sang 2 giếng kế tiếp cho đến hết A11, B11. Loại bỏ 50µl ở giếng A11, B11.
Bước 2: Cho hồng cầu 0.8%
Pha dung dịch hồng cầu 0.8% trong PBS
Thêm đều vào mỗi giếng 50µl hồng cầu gà 0.8%.
Gãi nhẹ đáy giếng để trộn đều, để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút.
Bước 3: Đọc kết quả
Giếng được coi là không ngưng kết (HA âm tính) chỉ có hồng cầu lắng đọng ở đáy giếng, giống như ở giếng đối chứng hồng cầu. Nghiêng đĩa ở một góc khoảng 450 hồng cầu lắng ở đáy chảy thành dòng.
Giếng được đánh giá là có ngưng kết (HA dương tính) không có hồng cầu lắng ở đáy, các hồng cầu tạo mạng lưới chân chim.
Phƣơng pháp HI (haemagglutination inhibition)
Cách tiến hành: Sẽ tiến hành phản ứng trên đĩa 96 giếng đáy hình chữ U.
Bước 1: Chuẩn 4HA
Mục đích: xác định pha loãng của kháng nguyên tại đó 50µl kháng nguyên pha loãng chứa 4 đơn vị HA
Các bước tiến hành như mục phương pháp HA
Bước 2: Pha loãng huyết thanh
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 [HT] A HT01 B HT02 C HT03 D HT04 E HT05 F -Ve G +Ve H HC
Ghi chú: HT01-HT05 là mẫu huyết thanh theo thứ tự từ 1-5, -Ve là đối chứng âm, +Ve là đối chứng dương, HC là đối chứng hồng cầu
Thêm vào giếng ở cột 01 tuần tự A01-G01, mỗi giếng 50µl huyết thanh xét nghiệm (đã xử lý 560C, 30 phút).
Trộn đều, chuyển 50µl sang giếng kế tiếp. Tiếp tục thực hiện cho đến hết cột 12. Loại bỏ 50µl ở giếng cột 12.
Bước 3: Cho kháng nguyên 4HA
Pha kháng nguyên 4HA trong PBS.
Thêm vào mỗi giếng 50µl kháng nguyên 4HA (đối chứng hồng cầu thêm 50µl PBS).
Ủ ở 370C trong 30 phút.
Bước 4: Cho hồng cầu 0.8%
Thêm đều vào mỗi giếng 50µl hồng cầu gà 0.8%.
Gãi nhẹ đáy giếng để trộn đều, để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút
Bước 5: Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm tròn, khi nghiêng đĩa hồng cầu chảy thành dòng).
Phản ứng âm tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết ở các giếng phản ứng. Mẫu huyết thanh sau khi tiêm vắc xin EDS có HGKT ≥ 8log 2 được coi là đạt bảo hộ.
3.3.4. Phƣơng pháp xác định EID50
Xác định chỉ số EID50: Dùng phương pháp Reed- Muench.
+ Chuẩn bị trứng: Chuẩn bị 50 trứng vịt ấp 10 - 11 ngày tuổi có phôi khỏe mạnh.
+ Chuẩn bị giống: Giống vi rút được pha loãng với PBS 1X vô trùng theo cơ số 10 từ 10-1 đến 10-10.
+ Mỗi nồng độ pha loãng vi rút được tiêm với 5 phôi, liều 0.2 ml/phôi. Tiếp tục ấp trứng ở 370C, độ ẩm 62%. Loại những trứng có phôi chết trong vòng 24h sau khi gây nhiễm. Soi kiểm tra trứng hằng ngày. Ghi chép số lượng phôi sống, phôi chết.
Bảng 3.1. Công thức Reed & Muench tính EID50 Nồng độ pha loãng Phôi nhiễm Phôi không nhiễm Tổng phôi nhiễm I Tổng phôi không nhiễm N Phần trăm i/(i+n) ×100 10-2 A G A+B+C+D+E+F G M 10-3 B H B+C+D+E+F H+G L 10-4 C I C+D+E+F I+H+G O 10-5 D J D+E+F J+I+H+G P 10-6 E K E+F K+J+I+H+G Q 10-7 F L F L+K+J+I+H+G R
Tỷ lệ nhiễm (%) = Số lượng nhiễm/ (Tổng số nhiễm + Tổng số không nhiễm) x 100
A - 50
EID50 = x (b - a) + a A - B
A: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%. B: là tỉ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%.
a: liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng vi rút. b: liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng vi rút.
3.3.5. Xác định vi rút và chuẩn độ vi rút EDS trong nƣớc trứng thu đƣợc
Xác định sự có mặt của vi rút EDS trong nước trứng thu được bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gà (HA) theo quy trình của OIE (2008, 2009).
Chuẩn độ vi rút xác định hiệu giá vi rút EDS trên phôi vịt 10 ngày tuổi theo phương pháp Reed - Muench
3.3.6. Bất hoạt vi rút
Sử dụng các nồng độ formol 0,05%, 0,1%, 0,2% để vô hoạt EDS’76 trong nước trứng bằng cách cho vào tủ ấm lắc cài đặt số vòng rpm:150, time:24h, nhiệt độ:40C sau đó kiểm tra vi rút sau vô hoạt trên phôi vịt 11 ngày tuổi.
3.3.7. Kiểm tra bất hoạt Bƣớc 1: Kiểm tra an toàn Bƣớc 1: Kiểm tra an toàn
Kiểm tra an toàn nước trứng sau bất hoạt (thực hiện cấy tối thiểu 2 lần trên trứng để chắc chắn vi rút được bất hoạt hoàn toàn). Tiêm 0.2ml nước trứng sau bất hoạt vào 5 trứng vịt có phôi 10-11 ngày tuổi. Ấp trứng ở 370
C trong 5 ngày. Ghi lại số trứng chết. Kiểm tra hiệu giá HA. Nếu có HA lặp lại bước bất hoạt vi rút. Nếu không
có hiệu giá HA tiếp tục tiêm trứng lần 2 và kiểm tra HA. Nếu kiểm tra HA của nước trứng tiêm lần 2 âm tính tức bất hoạt thành công chuyển sang bước tiếp theo.
Bƣớc 2: Li tâm và chỉnh hiệu giá
Sau khi hoàn thành công đoạn bất hoạt virut, nước trứng được làm ấm ở nhiệt độ phòng và điều chỉnh pH về mức 7,3- 7,4 bằng dung dịch sodium bicarbonate 7,5%. Điều chỉnh hiệu giá vi rút về lượng thích hợp tiêm.
Ly tâm 3000 vòng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ 40C để loại bỏ toàn bộ cặn lắng tạo ra trong quá trình bất hoạt.
Bƣớc 3: Kiểm tra vô trùng nƣớc trứng sau bất hoạt
Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, tạp nhiễm nấm mốc theo tiêu chuẩn TCVN- 8684:2011.
3.3.8. Phƣơng pháp nhũ hóa vắc xin
- Nhũ hóa bằng nhũ dầu khoáng kép ISA 71VG của hãng Seppic (Pháp)
- Tỷ lệ kháng nguyên: Nhũ dầu khoáng kép 70:30 (một phần huyễn dịch vắc xin với 1 phần nhũ dầu khoáng kép).
- Phối trộn vắc xin (kháng nguyên và chất bổ trợ) thực hiện trên tank nhũ hóa vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: cấp dầu khoáng kép ISA 71VG đã tiệt trùng vào tank nhũ hóa, khuấy nhẹ nhàng ít nhất 10 phút
+ Bước 2. cấp kháng nguyên theo tỷ lệ 70:30, vừa cấp kháng nguyên vừa tiếp tục khuấy đến khi quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất.
+ Bước 3. Tạo nhũ bằng máy khuấy chuyên dụng tại tốc độ 2000 - 3500 vòng/phút trong 10-20 phút.
3.3.9. Phƣơng pháp kiểm tra sau nhũ hóa vắc xin
- Kiểm tra sự ổn định và đồng nhất: Sử dụng bơm tiêm 1 ml nhỏ mẫu vào ống môi trường TSB, yêu cầu giọt vắc xin không tan vào môi trường TSB.
- Lấy 40 ml vi rút vắc xin sau nhũ hóa cho vào 04 ống fancol 15, ly tâm 02 ống fancol này tại tốc độ 3500 vòng/phút trong thời gian 35 phút, yêu cầu vắc xin không bị tách lớp > 30%, Để 01 ống vắc xin vào môi trường 370
C trong 24h và 01 ống vắc xin vào môi trường 40C trong 7 ngày, yêu cầu mẫu vắc xin không bị tách lớp.
- Làm tiêu bản vắc xin và soi dưới kính hiển vi độ phóng đại tối thiểu 400 lần, yêu cầu hạt nhũ có kích thước nhỏ và đều.
3.3.10. Quy trình sản xuất vắc xin
Quy trình sản xuất vắc xin EDS’76 nhũ dầu chế trên phôi vịt được tóm tắt theo sơ đồ Hình 3.1.
Hình 3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin EDS’76 nhũ dầu chế trên phôi vịt
3.3.11. Kiểm tra chất lƣợng vắc xin
3.3.11.1. Vô trùng
Theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011. Cụ thể như sau:
Dán nhãn bảo quản 2 - 80C Ra chai Nhũ hóavới chất bổ trợ Montanide ISA 71 VG Kiểm nghiệm vacxin
Vô hoạt bằng Formol
Kiểm tra vô hoạt
Ấp tiếp ở 370C, độ ẩm 62% . Thu trứng, để lạnh 40
C/12h Mổ trứng
Kiểm tra vô trùng
Thu chất chứa virus Chuẩn độ hiệu giá virus
Gây nhiễm phôi trứng Nhân giống sản xuất EDS’76
Kiểm tra vô trùng
Giống gốc Pha với PBS
- Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn
Cấy mẫu vi rút trên các môi trường kiểm tra sau đây: Thạch máu, thạch nấm, thạch MacConkey, nước thịt, Yếm khí, mỗi loại 2 ống; lượng mẫu cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra. Nếu mẫu ở dạng đông khô thì phải được hoà tan trở lại dung tích ban đầu. Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày. Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
- Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc
Mẫu vi rút được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud hoặc sản phẩm thủy phân casein đậu tương. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 200C đến 250C). Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
- Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
Mẫu vi rút được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng độ 1% mẫu kiểm tra trong 100ml môi trường và trên thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1ml dung lượng mẫu trên 1 đĩa. Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33-370C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm ở 370
C có 5% khí CO2, theo dõi trong 28 ngày. Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.
3.3.11.2. Chỉ tiêu vật lý
Theo phương pháp Drop test và quan sát độ ổn định của vắc xin ở điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng và ở 2 - 60C.
Phương pháp Drop test (theo qui trình của hãng SEPPIC): Dùng cốc đong có thể tích 250 ml chứa 200ml nước cất. Nhỏ 1 giọt vắc xin (≈ 3 mg) lên bề mặt nước (chú ý không khuấy). Nếu giọt vắc xin lan nhanh, nổi trên bề mặt nước kể cả khi lắc nhẹ cốc đong thì vắc xin đạt yêu cầu là vắc xin nước trong dầu (water in oil).
Kiểm tra độ ổn định của vắc xin (theo qui trình của hãng SEPPIC): Chia vắc xin vào 2 chai nhựa loại 20 ml rồi đạy chặt nắp, 1 chai bảo quản ở 2- 60
C và 1 chai bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20-250C). Theo dõi sự thay đổi của vắc xin sau 2 tuần, 1 tháng, 6 tháng, 1 năm. Vắc xin phải trắng và đồng nhất từ trên
xuống đáy hoặc có thể có một lớp dầu (< 10% thể tích) trên bề mặt hoặc có thể tầng đáy có màu trắng hơn nhưng khi lắc đều lại trở nên đồng nhất là được. Vắc xin phải giữ được độ ổn định sau 2 năm ở điều kiện bảo quản 2 - 60C và khoảng 1 tháng ở nhiệt độ phòng.
3.3.11.3. Chỉ tiêu an toàn, hiệu lực của vắc xin trên gà
Theo tiêu chuẩn TCVN 8685 -4:2011 “vắc xin thú y - Quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt EGG DROP SYNDROME”
a. Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng 35 gà chia làm 3 lô như bảng 3.2 để kiểm tra an toàn và hiệu lực
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm tại nhà nuôi động vật
Lô gà Số con/lô Liều vắc xin và đƣờng dùng Phƣơng pháp đánh giá
Lô I:
Đối chứng 5 Không dùng vắc xin HI Lô II:
An toàn 10
2 liều vắc xin ghi trên nhãn/gà, tiêm bắp
Theo dõi 14 ngày tất cả gà phải sống
Lô III:
Hiệu lực 20
01 liều vắc xin ghi trên nhãn/gà,
tiêm bắp HI
b. Phương pháp tiến hành
Trước khi chủng vắc xin, lấy máu toàn đàn gà thí nghiệm. Mỗi con lấy 0,5 - 1 ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dùng để xét nghiệm. Sau khi xét nghiệm chọn lựa gà có kết quả âm tính tiến hành sử dụng vắc xin trên đàn gà thử nghiệm.
Đàn gà được theo dõi liên tục 21 ngày sau khi tiêm vắc xin, mỗi ngày quan