Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.10. Quy trình sản xuất vắcxin
Quy trình sản xuất vắc xin EDS’76 nhũ dầu chế trên phôi vịt được tóm tắt theo sơ đồ Hình 3.1.
Hình 3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin EDS’76 nhũ dầu chế trên phôi vịt nhũ dầu chế trên phôi vịt
3.3.11. Kiểm tra chất lƣợng vắc xin
3.3.11.1. Vô trùng
Theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011. Cụ thể như sau:
Dán nhãn bảo quản 2 - 80C Ra chai Nhũ hóavới chất bổ trợ Montanide ISA 71 VG Kiểm nghiệm vacxin
Vô hoạt bằng Formol
Kiểm tra vô hoạt
Ấp tiếp ở 370C, độ ẩm 62% . Thu trứng, để lạnh 40
C/12h Mổ trứng
Kiểm tra vô trùng
Thu chất chứa virus Chuẩn độ hiệu giá virus
Gây nhiễm phôi trứng Nhân giống sản xuất EDS’76
Kiểm tra vô trùng
Giống gốc Pha với PBS
- Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn
Cấy mẫu vi rút trên các môi trường kiểm tra sau đây: Thạch máu, thạch nấm, thạch MacConkey, nước thịt, Yếm khí, mỗi loại 2 ống; lượng mẫu cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra. Nếu mẫu ở dạng đông khô thì phải được hoà tan trở lại dung tích ban đầu. Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày. Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
- Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc
Mẫu vi rút được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud hoặc sản phẩm thủy phân casein đậu tương. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 200C đến 250C). Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
- Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
Mẫu vi rút được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng độ 1% mẫu kiểm tra trong 100ml môi trường và trên thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1ml dung lượng mẫu trên 1 đĩa. Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33-370C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm ở 370
C có 5% khí CO2, theo dõi trong 28 ngày. Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.
3.3.11.2. Chỉ tiêu vật lý
Theo phương pháp Drop test và quan sát độ ổn định của vắc xin ở điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng và ở 2 - 60C.
Phương pháp Drop test (theo qui trình của hãng SEPPIC): Dùng cốc đong có thể tích 250 ml chứa 200ml nước cất. Nhỏ 1 giọt vắc xin (≈ 3 mg) lên bề mặt nước (chú ý không khuấy). Nếu giọt vắc xin lan nhanh, nổi trên bề mặt nước kể cả khi lắc nhẹ cốc đong thì vắc xin đạt yêu cầu là vắc xin nước trong dầu (water in oil).
Kiểm tra độ ổn định của vắc xin (theo qui trình của hãng SEPPIC): Chia vắc xin vào 2 chai nhựa loại 20 ml rồi đạy chặt nắp, 1 chai bảo quản ở 2- 60
C và 1 chai bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20-250C). Theo dõi sự thay đổi của vắc xin sau 2 tuần, 1 tháng, 6 tháng, 1 năm. Vắc xin phải trắng và đồng nhất từ trên
xuống đáy hoặc có thể có một lớp dầu (< 10% thể tích) trên bề mặt hoặc có thể tầng đáy có màu trắng hơn nhưng khi lắc đều lại trở nên đồng nhất là được. Vắc xin phải giữ được độ ổn định sau 2 năm ở điều kiện bảo quản 2 - 60C và khoảng 1 tháng ở nhiệt độ phòng.
3.3.11.3. Chỉ tiêu an toàn, hiệu lực của vắc xin trên gà
Theo tiêu chuẩn TCVN 8685 -4:2011 “vắc xin thú y - Quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt EGG DROP SYNDROME”
a. Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng 35 gà chia làm 3 lô như bảng 3.2 để kiểm tra an toàn và hiệu lực
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm tại nhà nuôi động vật
Lô gà Số con/lô Liều vắc xin và đƣờng dùng Phƣơng pháp đánh giá
Lô I:
Đối chứng 5 Không dùng vắc xin HI Lô II:
An toàn 10
2 liều vắc xin ghi trên nhãn/gà, tiêm bắp
Theo dõi 14 ngày tất cả gà phải sống
Lô III:
Hiệu lực 20
01 liều vắc xin ghi trên nhãn/gà,
tiêm bắp HI
b. Phương pháp tiến hành
Trước khi chủng vắc xin, lấy máu toàn đàn gà thí nghiệm. Mỗi con lấy 0,5 - 1 ml máu ở tĩnh mạch, chiết lấy huyết thanh dùng để xét nghiệm. Sau khi xét nghiệm chọn lựa gà có kết quả âm tính tiến hành sử dụng vắc xin trên đàn gà thử nghiệm.
Đàn gà được theo dõi liên tục 21 ngày sau khi tiêm vắc xin, mỗi ngày quan sát 2 lần.
Lấy máu gà sau miễn dịch: lấy 45 mẫu máu lô miễn dịch và 20 mẫu lô đối chứng tại các thời điểm 14 ngày và 21 ngày, 28 ngày sau khi gây miễn dịch.
Phương pháp đánh giá kết quả: Phương pháp HI.
3.3.12. Phƣơng pháp tiêm vắc xin và thu thập huyết thanh
Gà được lựa chọn làm thí nghiệm là gà 4-6 tuần tuổi được kiểm tra kháng thể kháng vi rút EDS bằng phương pháp HI. Gà đạt tiêu chuẩn thí nghiệm không có kháng thể kháng vi rút EDS.
Bƣớc 1: Tiêm vắc xin
liều 0.5ml/con, lô vắc xin 30 con. Lô đối chứng 10 con được tiêm 0.5ml nhũ dầu.
Bƣớc 2: Lấy mẫu định kỳ 7, 14, 21 và 28 ngày
Máu được lấy ở tĩnh mạch cánh của gà.
Mẫu máu được bảo quản trong ống Eppendorf 1.5 ml.
Bƣớc 3: Xử lí mẫu
Mẫu mang về phòng thí nghiệm để trong tủ ấm 370
C trong 2 - 3 giờ, sau đó để 40C trong vòng 2 giờ để ra huyết thanh.
Bƣớc 4: Ly tâm chắt huyết thanh.
Li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Thu huyết thanh.
Mẫu huyết thanh được bất hoạt nhiệt ở 560C trong 30 phút trước khi tiến hành HI
Bƣớc 5: Bảo quản mẫu.
Mẫu huyết thanh chờ làm thí nghiệm được bảo quản trong 40C. Mẫu huyết thanh dùng để lưu mẫu được bảo quản trong -300C.
3.3.13. Phƣơng pháp thu thập số liệu, xử lý thống kê sinh học
Phương pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vắc xin và kỹ thuật chủng vắc xin thực hiện theo quy trình quy định sẵn.
Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà được chủng vắc xin EDS’76 bằng phản ứng HI.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Để có vắc xin phòng bệnh cho đàn gà góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh trên gia súc, gia cầm. Quy trình sản xuất vắc xin trên phôi vịt 10-11 ngày tuổi từ vi rút phòng hội chứng giảm đẻ vô hoạt chủng EDS’76 được thực hiên qua các bước sau:
1. Kiểm định và bảo quản giống - Giống gốc
- Giống sản xuất 2. Chuẩn bị trứng
3. Chuẩn bị dụng cụ, hoá chất 4. Cấy vi rút sản xuất vắc xin
5. Thu hoạch, xử lý và kiểm tra vô trùng 6. Bất hoạt vi rút
7. Sản xuất vắc xin thành phẩm
8. Kiểm nghiệm thành phẩm theo tiêu chuẩn TCVN 8685-4:2011
Ở mỗi khâu sản xuất đều yêu cầu kỹ thuật chặt chẽ từ nguyên liệu môi trường, thao tác kỹ thuật,... Chỉ cần một khâu bị sai sót là có thể làm ảnh hưởng đến toàn bộ quả trình sản xuất vắc xin gây nhiều thiệt hại về kinh tế. Vì vậy, chúng tôi hết sức chú trọng trong quá trình này.
Bên cạnh đó, theo quy định, bất cứ loại vắc xin nào trước khi xuất xưởng bắt buộc phải kiểm tra đủ 3 chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. Đây là những chỉ tiêu chính và cũng là những chỉ tiêu quan trọng không thể thiếu trong quá trình kiểm nghiệm đối với mỗi loại vắc xin.
4.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN VÔ HOẠT NHŨ DẦU PHÒNG HỘI CHỨNG GIẢM ĐẺ EDS’76 HỘI CHỨNG GIẢM ĐẺ EDS’76
4.1.1. Xác định liều gây nhiễm vi rút EDS trên phôi trứng vịt 10-11 ngày và thời gian thu vi rút trên phôi trứng vịt thời gian thu vi rút trên phôi trứng vịt
Chúng tôi thực hiện sản xuất huyễn dịch vi rút từ giống vi rút EDS’76 (có hiệu giá vi rút giống ban đầu HA=11 log2) để thực hiện sản xuất vắc xin. Lượng vi rút thu được trong quá trình sản xuất liên quan chặt chẽ đến nồng độ vi rút gây nhiễm và thời gian thu hoạch vi rút.
Để xác định liều gây nhiễm thích hợp và thời gian thu hoạch tốt nhất chúng tôi đã tiến hành gây nhiễm vi rút phôi vịt 11 ngày tuổi. Với liều gây
nhiễm chúng tôi thực hiện 3 nồng độ pha loãng 200 EID50, 500 EID50, 1000 EID50/trứng, với mỗi nồng độ 20 phôi vịt 11 ngày tuổi.
Trứng sau khi tiêm sẽ được tiếp tục ấp và thu hoạch tại các thời điểm 72h, 84h và 96h, 120h sau gây nhiễm mỗi nồng độ 5 phôi vịt. Mẫu được đánh giá hiệu giá HA là mẫu gộp của mỗi 5 trứng thu hoạch. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm được trình bày tại bảng 4.1 sau:
Bảng 4.1. Xác định liều gây nhiễm và thời gian thu hoạch
Lần thí nghiệm (n) Thời gian theo dõi Số lƣợng phôi 200 EID50/trứng 500 EID50/trứng 1000 EID50/trứng Hiệu giá HA (Log2) Hiệu giá HA (Log2) Hiệu giá HA (Log2) Lần 1 72h 5 4 5 6 84h 5 9 9 10 96h 5 12 11 11 120h 5 12 12 12 Lần 2 72h 5 4 4 6 84h 5 8 9 10 96h 5 12 11 10 120h 5 12 12 12 Lần 3 72h 5 5 4 6 84h 5 10 9 10 96h 5 12 11 11 120h 5 12 12 12
Từ bảng 4.1 cho thấy ở các liều gây nhiễm khác nhau và thời gian thu hoạch khác nhau cho hiệu giá HA cũng khác nhau.
Qua 3 lần thí nghiệm lặp lại chúng tôi thấy tại thời điểm 72h sau gây nhiễm, hiệu giá HA xuất hiện nhưng đều ở mức thấp (4-6HA) tại cả 3 độ pha loãng của vi rút gây nhiễm. Hiệu giá vi rút tăng cao ở thời đểm 12h tiếp theo lên mức 9-10 HA, trong đó mức 10HA thu được ở trứng được gây nhiễm với 1000EID50. Tại hai thời điểm tiếp theo, hiệu giá HA thu được đều tăng và ổn định ở mức 11-12HA cho cả 3 nồng độ gây nhiễm, tuy nhiên hiệu giá đối với liều gây nhiễm 200EID50 cho kết quả ổn định ngay tại 96h là 12HA.
Kết quả trên cho thấy, cả 3 nồng độ gây nhiễm đều cho kết quả thu được hiệu giá HA đạt 12HA, tuy nhiên thời điểm đạt ngưỡng sớm nhất đối với 200EID50 là 96h. Kết quả trên đã được chúng tôi kiểm chứng lặp lại bằng thí nghiệm tương tự và thí nghiệm khoanh vùng. Kết quả thí nghiệm chúng tôi phù
hợp với báo cáo và các công trình nghiên cứu trước đây, tuy nhiên có thể thu hoạch được với thời gian gây nhiễm sớm hơn, 96h so với 120h (Bartha 1984, Elneel and R.M.D.H 2006). Thời gian thu sớm hơn đem lại hiệu quả cao hơn về thể tích nước trứng thu hoặc trên mỗi trứng, do phôi càng to thì tỷ lệ nước trứng thu hoạch sẽ theo tỷ lệ nghịch là giảm xuống.
Hiệu giá vi rút của huyễn dịch vi rút tương ứng với các liều gây nhiễm được thể hiện ở biểu đồ
Hình 4. 1. Liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch
Việc xác định liều gây nhiễm và thời gian thu hoạch tối ưu ảnh hưởng lớn tới hiệu quả của việc sản xuất kháng nguyên sau này trong sản xuất vắc xin. Trong nghiên cứu này 200 EID50/trứng và thu hoạch ở 96h đã được xác định là tối ưu cho vi rút EDS’76.
4.1.2. Nghiên cứu tối ƣu nồng độ chất bất hoạt trong vắc xin
Chất bất hoạt sử dụng trong vắc xin đảm bảo bất hoạt hoàn toàn vi rút , không thay đổi tính kháng nguyên của vi rút, an toàn khi tiêm cho động vật thí nghiệm. Dựa trên cơ sở những nghiên cứu trước đây, chúng tôi lựa chọn thử nghiệm bất hoạt bằng Formol ở nồng độ chất bất hoạt 0.05%, 0.1% và 0.2%. Quy trình bất hoạt vi rút được thực hiện như sau và được lặp lại 3 lần kiểm tra:
(1) Điều kiện bất hoạt 40 C thời gian bất hoạt 24 giờ.
(2) Kiểm tra bất hoạt trên trứng và thực hiện HA để đánh giá khả năng bất hoạt.
4 5 6 9 9 10 12 11 11 12 12 12 0 2 4 6 8 10 12 14
200 EID50 500 EID50 1000 EID50
72H 84H 96H 120H Hi ệu giá HA (l og2 )
(3) Kiểm tra an toàn kháng nguyên sau bất hoạt trên gà thí nghiệm.
Kháng nguyên sau khi được bất hoạt ở 3 nồng độ Formalin 0,05%, 0,1% và 0,2% trong cùng điều kiện bất hoạt 40 C thời gian bất hoạt 24 giờ được thu và đánh giá các chỉ tiêu.
Kiểm tra vi rút sau vô hoạt
Kiểm tra theo tiêu chuẩn TCVN 8685-4:2011. Để kiểm tra tính an toàn của kháng nguyên giống vi rút EDS sau vô hoạt đảm bảo không còn vi rút sống. Chúng tôi sử dụng nước trứng chứa vi rút với hiệu giá trước bất hoạt là HA=12 log 2 . Sau khi bất hoạt vi rút ở điều kiện 40C trong 24 giờ chúng tôi tiến hành tiêm cho 10 phôi thai vịt 11 ngày tuổi mẫn cảm với vi rút EDS, mỗi phôi được tiêm 0,2 ml vào xoang niệu rồi chuyển vào tủ ấp 370C được ấp tiếp 3-7. Sau 5 ngày chúng tôi tiến hành giết trứng, mổ thu hoạch nước trứng và kiểm tra bệnh tích phôi vịt. Nước trứng sau thu hoạch được kiểm tra bằng phản ứng HA để phát hiện sự có mặt của giống vi rút EDS. Nước trứng sau thu hoạch lần 1 ở giống vi rút được chúng tôi tiếp tục sử dụng để tiêm truyền lặp lại trên phôi vịt lần 2. Kết quả được thể hiện ở bảng.
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu bất hoạt kháng nguyên EDS với formol ở ba nồng độ 0,05%, 0,1%, 0,2% Chất bất hoạt Kết quả HA lần 1 n (%) Kết quả HA lần 2 n (%) Tỷ lệ gây chết phôi n (%) Formol 0,05% (+) 10/10 (100%) (+) 10/10 (100%) 0/10 (0 %) Formol 0,1% (-) 10/10 (100%) (-) 10/10 (100%) 0/10 (0 %) Formol 0,2% (-) 10/10 (100%) (-) 10/10 (100%) 6/10 (60%
Ghi chú: «+» vẫn còn sự xuất hiện của vi rút trên trứng có phôi «-» Không có sự xuất hiện của vi rút trên trứng có phôi
Qua bảng 4.2. Kết quả sau 2 lần tiêm truyền liên tiếp trên phôi thai vịt 11 ngày tuổi, kết quả cho thấy ở nồng độ formol 0,05 % qua 2 lần kiểm tra chúng tôi thấy vi rút EDS chưa được vô hoạt hoàn toàn và vẫn còn vi rút sống (HA dương tính với vi rút EDS sau quá trình cấy chuyển kiểm tra). Nồng độ formol 0,2 %
sau 2 lần kiểm tra vi rút được vô hoạt hoàn toàn (HA âm tính) song gây tỷ lệ chết cao ở phôi vịt là 60%. Ở nồng độ formol 0,1% vi rút được vô hoạt hoàn toàn và không gây chết phôi vịt, phôi vịt phát triển bình thường tương tự phôi đối chứng. Kết quả này của chúng tôi phù hợp với công bố của McFerran & Smyth, 2000 (McFerran and Smyth 2000), do vậy, nồng độ formol phù hợp được sử dụng là 0,1% trung điều kiện 24h ở nhiệt độ 4oC trong các nghiên cứu tiếp theo.
Kháng nguyên sau khi được bất hoạt và kiểm tra bất hoạt trên phôi trứng vịt 11 ngày tuổi chúng tôi tiến hành kiểm tra an toàn kháng nguyên bất hoạt trên gà.
Kháng nguyên được tiêm với liều lượng 02 liều vắc xin cho 10 gà thí nghiệm và theo dõi 14 ngày. Đánh giá tình trạng của gà thí nghiệm so với gà đối chứng không tiêm kháng nguyên.
Sau 14 ngày chúng tôi thấy gà được tiêm an toàn trên gà với liều lượng 02 liều vắc xin tất cả 10 gà thí nghiệm đều khỏe mạnh và không có biểu hiện lâm sàng.
Kháng nguyên sau khi được bất hoạt và kiểm tra được bảo quản ở điều kiện 4oC để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.3. Nghiên cứu xác định liều vi rút sử dụng trong vắc xin
Để xác định được liều vi rút được sử dụng trong mỗi liều vắc xin, chúng tôi tiến hành xác định liều ở các dải khác nhau và được kiểm tra thông qua hiệu giá kháng thể thu được trong gà thí nghiệm.
Ba dải liều được xác định sử dụng dựa trên hiệu giá HA của vi rút sau bất