3.3.1. Động vật nghiên cứu
- Gà mắc bệnh do O. rhinotracheale lấy tại các ổ dịch tại các trại chăn nuôi gà Ai Cập.
3.3.2. Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu là: Máu, khí quản, phổi, máu của nhóm gà mắc bệnh do O.rhinotracheale gây ra tại các trại chăn nuôi.
3.3.3. Hóa chất
- Môi trường, hóa chất:
+ Thạch Columbia Blood Aagar Base (Oxoid); + Brain Heart Broth (Merck);
+ Catalase (Việt Nam); + Oxidase (Remel); + Kovac’s/Indol (Merck);
+ Tryple Sugar Iron Agar (Merck); + Urê;
+ Bộ Kít nhuộm Gram (Merck);
+ Kit chiết tách DNA: QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc., USA), + Hóa chất sinh phẩm thực hiện phản ứng PCR,
+ Agarose,
+ Ethidium bromide, + 100bp DNA Ladder; + Formon 10%;
+ Kháng sinh bổ sung vào trong môi trường thạch máu: gentamycin, pholymycin B (Công ty cổ phần dược vật tư y tế Thanh Hóa)...;
- Trang thiết bị phòng thí nghiệm:
+ Tủ ấm CO2, + Cabinet vô trùng, + Máy Vortex, + Tủ lạnh dương,
+ Tủ lạnh âm sâu (-86°C);
+ Pipette 1000, 100, 10μl và đầu type tương ứng; + Đèn cồn, bật lửa, bông cồn, bình xịt cồn, + Que cấy, que láng,
+ Bút viết kính,
+ Đĩa petri, ống nghiệm, nút bông…;
- Dụng cụ bảo hộ lao động: Mũ, khẩu trang, găng tay, quần, áo, ủng…; - Dụng cụ lấy mẫu: Khay inox, pank, dao, kéo, kẹp, Seringe, túi Zip vô trùng, tăm bông vô trùng, bông cồn, bình xịt cồn…
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Kết quả nghiên cứu chẩn đoán bệnh ORT bằng phương pháp phân lập vi khuẩn lập vi khuẩn
3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh ORT
- Nghiên cứu một số biểu hiện triệu chứng lâm sàng của gà Ai Cập mắc ORT;
- Nghiên cứu một số biến đổi bệnh tích đại thể của gà Ai Cập mắc ORT; - Nghiên cứu một số biến đổi bệnh tích vi thể của gà Ai Cập mắc ORT; - Nghiên cứu chỉ tiêu huyết học của gà Ai Cập mắc ORT.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Quan sát triệu chứng lâm sàng, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể, toàn đàn và thu thập mẫu (Swabs khí quản, mẫu máu (thu huyết thanh), mẫu gà nếu con vật chết hoặc có triệu chứng điển hình).
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Gà mắc ORT được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ các cơ quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể; lưu lại các hình ảnh bệnh tích đặc trưng.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định.
Mẫu cơ quan tổ chức được lấy đúng (lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình), lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).
Mẫu có thể là dịch mũi, dịch hầu họng và dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta có thể lấy mẫu theo phương pháp sau:
- Đối với dịch mũi và dịch ngoáy hầu họng: dùng tăm bông vô trùng lấy dịch mũi, hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70° để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bôn. Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart TranspORT Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS (dung dịch muối đệm phosphat), đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2 - 8h; các cơ quan hoặc bộ phận ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản bệnh lý. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
- Đối với dịch khí quản hay dịch phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trường như trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm cho và túi zip và bảo quản tương tự như trên.
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia Blood Aagar Base (CBA) đã bổ sung 10μg/ml gentamycin hoặc bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymycin B, ủ 37°C, 5% CO2, ở điều kiện hiếu khí trong thời gian 24 - 48 giờ.
Lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển sang môi trường tương tự hoặc tăng sinh trên môi trường Brain Heart Broth (BHB) để thử một số đặc tính sinh hóa: Catalase; Oxidase; Kovac’s/Indol; một số phản ứng lên men đường: Sucrose, Lactose, Glucose…; phản ứng phân giải Urê…
3.5.5. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol 10% trung tính để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Cố định bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%. - Vùi bệnh phẩm và đúc block: đúc mẫu bệnh phẩm trong paraffin. - Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
- Nhuộm tiêu bản
- Gắn Baume canada và đọc bệnh tích vi thể trên kính hiển vi quang học.
3.5.6. Phương pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Phân tích các chỉ tiêu hệ hồng cầu và bạch cầu bằng máy Celldyn-3700 tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú Y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.5.7. Xử lý số liệu
Số liệu được ghi chép và lưu trong file excel. Các tỉ lệ, số trung bình và độ lệnh chuẩn được tính toán trong phần mềm Excel, Microsoft Windows, phiên bản 7.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN BỆNH ORT BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI KHUẨN PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI KHUẨN
4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm
Trong quá trình theo dõi, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên ở 6 xã khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và ở giống gà Ai Cập đang mắc bệnh để tiến hành quan sát.
Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm gà Ai cập mắc ORT
STT Địa điểm mẫu Số lượng
mẫu (con)
Nhóm gà (con)
3-6 tuần 7-20 tuần Trên 20 tuần
1 Đồng Tĩnh 15 7 5 3 2 Hoàng Lâm 12 6 4 2 3 Hợp hòa 8 5 1 2 4 Kim Lang 6 3 1 2 5 Thanh Vân 6 3 2 1 6 Đạo Tú 4 1 2 1 Tổng 51 25 15 11
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: trong tổng số 51 mẫu thu thập được, có 25 mẫu gà ở độ tuổi 3 đến 6 tuần tuổi; nhóm gà 7 đến 20 tuần có 14 mẫu và nhóm gà trên 20 tuần tuổi có số lượng mẫu nghi ngờ thấp nhất (11 mẫu).
Như vậy, ở các lứa tuổi của gà đều có nguy cơ nhiễm ORT. Nhưng tỷ lệ cao nhất là nhóm tuổi từ 3 - 6 tuần tuổi. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi cho rằng: bệnh ORT có thể gặp trên gà và gà tây ở mọi lứa tuổi, hay gặp nhất ở lứa tuổi gà giò và gà lớn. Gà thịt công nghiệp thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu phân lập vi khuẩn
Từ kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm ở trên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch máu.
Hình 4.1. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn ORT trên môi trường thạch máu
Kết quả hình 4.1 cho thấy: tại đĩa sơ cấp môi trường có bổ sung 10µg/ml gentamycin sau 24 giờ nuôi cấy hình thành khuẩn lạc nhỏ li ti, to bằng đầu đinh gim, có màu xám đến xám trắng. Tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc trên sang môi trường tương tự (hình B) hoặc môi trường giàu dinh dưỡng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Như vậy, việc bổ sung 10µg/ml gentamycin vào trong môi trừơng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT cho hiệu quả cao hơn so với việc không bổ sung hoặc bổ sung 5µg/ml gentamycin và polymycin B, các khuẩn lạc phát triển tương đối độc lập và rõ ràng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn ORT phân lập được đều kháng với kháng sinh gentamycin và phù hợp với nghiên cứu của Back
et al. (1997).
Tổng hợp kết quả phân lập ORT được từ các mẫu thu thập được được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT
Stt Địa điểm mẫu Số xét nghiệm (mẫu) Số mẫu
dương tính Tỷ lệ (%) 1 Đồng Tĩnh 15 10 66,66 2 Hoàng Tân 12 6 50 3 Hợp Hòa 8 5 62,5 4 Kim Lang 6 2 33,33 5 Thanh Vân 6 2 33,33 6 Đạo Tú 4 0 0,00 Tổng 51 25 49,01
Kết quả bảng 4.2 cho thấy: Trong 6 xã có 25 mẫu trong tổng số 51 mẫu cho khuẩn lạc dương, chiếm tỷ lệ 49,01% (25/51). Trong đó: Đồng Tính có 10 trong tổng số 15 mẫu cho khuẩn lạc dương, chiếm tỷ lệ 66,66%. xã Hoàng Tân có 6 trong số 12 mẫu cho khuẩn lạc dương, chiếm 5,00%. xã Hợp Hòa có 5 trong số 8 mẫu cho khuẩn lạc dương, chiếm 62,5%. Kim Lang và Thanh Vâncó tổng số bằng nhau (2 trong số 6 mẫu cho khuẩn lạc dương tính )chiếm 33,33%, . Đạo Tú có 4 mẫu nhưng không gặp khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn ORT .
4.1.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT
Kiểm tra đặc tính sinh hóa (Bảng 4.3) chúng tôi nhận thấy: 25/25 mẫu dương cho phản ứng glucose dương tính, chiếm tỷ lệ 100% (25/25). Có 22/25 mẫu khuẩn lạc dương cho phản ứng triple sugar iron agar âm tính; lysine decarboxylase và galactose dương tính, chiếm tỷ lệ khoảng 88% (22/25). 19/25 gốc khuẩn lạc cho phản ứng oxidase, urease, lactose, fructose dương tính; nitrate, gelatinase âm tính, chiếm 76% (19/25). Trong tổng số 25 gốc khuẩn lạc được kiểm tra, có 15 gốc cho phản ứng motility, catalase, Indole, MacConkey (hình 4.2), gram, sucrose âm tính, maltose dương tính, chiếm 60% (15/25). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng: vi khuẩn ORT cho phản ứng catalase, indol âm tính; phản ứng oxidase dương tính; các chủng ORT có khả năng phân giải đường fructose, galactose, glucose, lactose, maltose; không có khả năng phân giải đường sucrose và chúng có khả năng phân giải urê nhưng không có khả năng phân giải muối nitrate; không có khả năng di động và vi khuẩn không phát triển trên môi trường thạch nghiêng TSI (Soriano et al., 2002;
Pan et al., 2012).
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT
Chỉ tiêu Đối chứng Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương Tỷ lệ (%) Số mẫu âm Tỷ lệ (%) Glucose + 25 25 100 0 0,00 Triple sugar iron agar - 25 22 88 3 12 Lysine decarboxylase + 25 22 88 3 12 Galactose + 25 22 88 3 12 Oxidase + 25 25 100 0 0,00 Urease + 25 25 100 0 0,00 Nitrate - 25 19 76 6 24
Chỉ tiêu Đối chứng Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương Tỷ lệ (%) Số mẫu âm Tỷ lệ (%) Gelatinase - 25 19 76 6 24 Lactose + 25 19 76 6 24 Fructose + 25 19 76 6 24 Motility - 25 15 60 10 40 Catalase - 25 0 0,00 25 100 Indole - 25 0 0,00 25 100 Maltose + 25 15 60 10 40 MacConkey - 25 15 60 10 40 Gram - 25 15 60 10 40 Sucrose - 25 15 60 10 40
Hình 4.3. Nhuộm tiêu bản xem hình thái vi khuẩn 0RT
+ Tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, chúng tôi nhận thấy: ORT là vi khuẩn gram âm, bắt màu hồng hoặc đỏ, có kích thước dài ngắn khác nhau (đa hình thái) (Hình 4.4). Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu trước đây về vi khuẩn ORT - vi khuẩn gram âm, đa dạng về hình thái (kích thước vi khuẩn dài ngắn khác nhau), là vi khuẩn có dạng hình que (Zhara et al., 2013; Soriano et al
2002; Nguyễn Thị Lan và cs., 2016).
4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA GÀ MẮC BỆNH ORT CỦA GÀ MẮC BỆNH ORT
4.2.1. Kết quả nghiên cứu một số biểu hiện triệu chứng lâm sàng của gà mắc ORT mắc ORT
Xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh ORT là rất quan trọng vì giúp cho việc chẩn đoán phân biệt với các bệnh có biểu hiện triệu chứng tương tự dễ dàng hơn.
Theo dõi 25 gà có kết quả dương tính khi phân lập vi khuẩn ORT thuộc các đàn gà nuôi tại 6 xã tại huyện Tam Dương, tỉnh Vĩnh Phúc. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Triệu chứng lâm sàng của gà Ai Cập mắc ORT
Stt Triệu chứng Số mẫu theo dõi Số mẫu biểu hiện Tỷ lệ (%)
1 Tăng dịch tiết và vảy mỏ 25 25 100 2 Khó thở (vươn cổ để thở) 25 25 100
3 Giảm ăn 25 18 72
4 Sưng phù mí mắt 25 17 68
5 Lông xơ xác 25 15 60
6 Ủ rũ 25 14 56
Kết quả bảng 4.4 cho thấy: triệu chứng điển hình nhất của gà Ai Cập bị mắc ORT là: tăng dịch tiết và vảy mỏ, con vật khó thở (vươn cổ để thở), chiếm tỷ lệ 100% (25/25). Tiếp đến là con vật có hiện tượng giảm ăn, chiếm tỷ lệ 72% (18/25). Điều này có thể được lý giải như sau: do vi khuẩn ORT tấn công chủ yếu vào hệ hô hấp của vật chủ trong đó có khí quản. Khi đó, vi khuẩn đóng vai trò là vật lạ kích thích vào niêm mạc khí quản gây nên hiện tượng dị ứng, làm cho niêm mạc khí quản tăng tiết dịch. Mặt khác, theo thời gian mật độ vi khuẩn tấn công ngày một tăng cao do sức đề kháng của con vật giảm; dẫn đến lượng dịch tiết càng nhiều bít kín khí quản làm cho con vật khó thở hoặc thở khò khè; nếu, dịch nhiều và đặc con vật sẽ có biểu hiện vươn cổ lên để thở hoặc vảy mỏ. Quá trình hô hấp của con vật gặp khó khăn làm cho khả năng tiêu hóa thức ăn giảm nên con vật có hiện tượng giảm ăn.
Kết quả bảng 4.4 và biểu đồ 4.2 cũng cho thấy: con vật có hiện tượng sưng phù mí mắt, chiếm tỷ lệ khoảng 68% (17/25). Ngoài ra, con vật còn có một số triệu chứng như: lông xơ xác; con vật mệt mỏi, ủ rũ, chiếm tỷ lệ lần lượt là 60% và 56%.
Chúng tôi đã tiến hành quan sát 400 gà Ai Cập thuộc các đàn gà được xác định dương tính với ORT nuôi ở 6 xã tại huyện Tan Dương tỉnh Vĩnh Phúc và thấy các biểu hiện về thay đổi liên quan đến trứng, tỷ lệ ấp nở, tỷ lệ đẻ và tỷ lệ tăng trọng của đàn gà mắc bệnh. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Triệu chứng lâm sàng của gà Ai Cập đẻ trứng mắc ORT
Stt Triệu chứng Số theo dõi Số biểu hiện Tỷ lệ (%)
1 Chất lượng vỏ trứng kém 400 305 76,25 2 Giảm tỷ lệ ấp, nở 400 259 64,75 3 Kích thước trứng giảm 400 242 60,5 4 Trứng méo mó 400 225 56,25 5 Giảm tăng trọng 400 192 48 6 Giảm đẻ 400 153 38,25
Kết quả bảng 4.5 cho thấy: đối với gà đang thời gian đẻ trứng thì con vật có hiện tượng giảm tỷ lệ ấp, nở; chất lượng vỏ trứng kém, chiếm tỷ lệ lần lượt là 76,25% (305/400) và 64,75% (259/400). Trứng đẻ ra méo mó, chiếm tỷ lệ 60,5% (242/400) và kích thước trứng giảm, chiếm khoảng 56,25% (225/400).
Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây : triệu chứng lâm sàng ở gà thường xuất hiện ở 3 - 6 tuần tuổi với tỷ lệ chết vào khoảng 2 - 10% với các triệu chứng ủ rũ, giảm ăn, giảm tăng trọng và tăng dịch tiết và vảy mỏ, kèm theo có hiện tượng phù mặt. ORT có thể là nguyên nhân gây chết đột ngột (dưới 20% trong 2 ngày) ở gà con với sự nhiễm trùng não và xương sọ kèm theo hoặc không kèm theo các triệu chứng hô hấp.
Ở gà giống bố mẹ, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn đang đẻ trứng, giai đoạn