Phần 3 Vật liệ u, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
Phân lập, nuôi cấy, giám định nguyên nhân gây bệnh hại theo tài liệu của Mathur and Olga (1999)
3.4.2.1. Phân lập và nhân nuôi nấm gây bệnh lở cổ rễ và thối hạch trên môi trường
nhân tạo
Phương pháp đểẩm
Sau khi điều tra thu thập được mẫu bệnh (lá, thân, gốc) ngoài đồng ruộng chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, rửa sạch đất cát, cắt thành mẫu thích hợp
để trong hộp petri có giấy ẩm, đểở nhiệt độ thích hợp sau 2 – 3 ngày, đem kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định sơ bộ tác nhân gây bệnh.
Các môi trường nuôi cấy
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường nhân tạo PGA, PCA, WA.
+ Môi trường PGA (Potato glucose agar):
Thành phần: Khoai tây: 200g Agar: 20g
Đường glucose: 20g Nước cất: 1000ml
Điều chế môi trường: Khoai tây gọt sạch vỏ, thái lát mỏng, đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nước cất đủ
1000ml đem đun sôi lại.
Cho lần lượt Agar, đường khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi trường vào bình tam giác, hay ống nghiệm có đậy nút bạc (bình tam giác, ống nghiệm, hộp Petri đã được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1800C trong vòng 2 giờ). Sau
đó đem khử trùng trong nồi hấp ở áp suất 1.5 amt (1210C) trong 30 phút.
+ Môi trường PCA:
Thành phần: Khoai tây: 100g Agar: 20g
Cà rốt: 100g Nước cất: 1000ml
+ Môi trường WA
Thành phần: Agar: 20g Nước cất: 1000ml
Cách điều chế: Đun tan Agar trong nước cất sau đó khử trùng. Cách làm tương tự như các môi trường trên.
Phương pháp phân lập nấm
Phương pháp lấy mẫu: lấy mẫu lá, thân, rễ bệnh mới, điển hình cho bệnh cần nghiên cứu. Sau khi lấy mẫu cho vào túi nilon có lót giấy thấm ẩm, đem về phòng phân lập luôn hoặc bảo quản ở nhiệt độ 40C trong tủ lạnh.
Chọn những mẫu bệnh mới, vết bệnh điển hình sau đó rửa sạch. Chuẩn bị
dụng cụ: dao, panh, giấy thấm vô trùng, cốc thủy tinh đựng cồn (ethanol), cồn (ethanol) 70%, nước cất, 3 đĩa đựng nước cất, bàn thái. Khử trùng buồng cấy bằng cồn (ethanol) 70%.
Cắt mảnh mô bệnh thích hợp sau đó khử trùng bề mặt bằng cách dùng giấy mềm đã nhúng cồn (ethanol) 70% lau mặt lá hoặc bằng cách nhúng nhanh vào cồn (ethanol, rửa lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng.
Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ 1 – 3 mm (chứa cả
phần mô bệnh và mô khỏe), sau đó dùng panh vô trùng đặt lên môi trường nghèo dinh dưỡng (như WA, để nấm phát triển bào tử) hoặc môi trường chọn lọc, đặt những miếng cấy gần mép đĩa.
Bọc đĩa lại bằng nilon gói thực phẩm và đểởđiều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp để bào tử nấm hình thành. Theo dõi và kiểm tra sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh.
Sau khi nấm mọc, tiến hành cắt đầu sợi nấm cấy truyền sang các đĩa khác cho tới khi thu được nguồn nấm thuần khiết. Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm.
3.4.2.2. Nghiên cứu loài nấm gây bệnh lở cổ rễ và thối hạch
Chọn những cây bắp cải khỏe không bị bệnh. Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (isolate) đã nuôi cấy được trên môi trường rồi tưới hoặc phun trực tiếp lên cây
Giống cải bắp sử dụng để lây bệnh: Newtop (lai F1) chịu nhiệt.
+ Đối với bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani) tiến hành lây bệnh ở cổ rễ với 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 cây. Sử dụng cây bắp cải gia
đoạn cây con sau trồng từ 7-10 ngày. CT 1: Có sát thương CT2: Không sát thương
+ Đối với bệnh thối hạch (Sclerotinia sclerotiorum) cũng tiến hành lây bệnh như sau:
Sử dụng cây cải bắp giai đoạn trải lá bàng.
Lây bệnh trên lá với 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 5 cây, mỗi cây lây 10 vết.
CT 1: Có sát thương CT 2: Không sát thương
Lây bệnh ở cổ rễ gồm 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 cây.
CT 1: Có sát thương CT 2: Không sát thương Chỉ tiêu theo dõi:
+ Theo dõi trong 7 ngày
+ Ngày phát bệnh, thời kì tiềm dục + Quan sát và ghi nhận các triệu chứng
+ Đếm số vết biểu hiện triệu chứng bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%)
3.4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của
nấm Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum.
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗđục 5mm) trên các môi trường PCA, PGA, WA.
Đối với mỗi loài nấm bệnh tiến hành thí nghiệm với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. Theo dõi đến khi nấm mọc kín đĩa.
CT 1: Cấy nấm bệnh trên môi trường PGA CT 2: Cấy nấm bệnh trên môi trường PCA CT 3: Cấy nấm bệnh trên môi trường WA Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm).
3.4.2.4. Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia
solani bằng nấm đối kháng Trichoderma hazianum
Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri.
Công thức 1: Cấy nấm Trichoderma, sau 24 giờ cấy nấm gây bệnh Công thức 2: Cấy nấm gây bệnh, sau 24 giờ cấy nấm Trichoderma
Công thức 3: Cấy nấm Trichoderma đồng thời với nấm gây bệnh
Công thức 4: Đối chứng, cấy nấm gây bệnh và cấy nấm Trichoderma riêng biệt. Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đường kính tản nấm của nấm Trichoderma và nấm gây bệnh ở các công thức.
Đánh giá hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm gây bệnh theo công thức Abbott:
C - T
HLĐK (%) = --- x 100 C
Trong đó:
C: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng
T: đường kính tản nấm ở công thức có xử lý nấm Trichoderma hazianum.
3.4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma
hazianum kết hợp với Clorua đồng dạng vi lượng đến sự phát triển của nấm gây
bệnh lở cổ rễ, thối hạch trên cây cải bắp.
* Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại tại xã Tiên Dương – huyện Đông Anh – Hà Nội gồm 4 công thức, mỗi công thức là 1 ô có diện tích 30 m2 có dải bảo vệ xung quanh. Tổng diện tích làm thí nghiệm là 420m2.
- Công thức 1: 4kg chế phẩm/ sào ủ với 400kg phân chuồng trước khi bón lót. (trong khi trồng).
- Công thức 2: 4kg chế phẩm/ sào ủ với phân chuồng trước khi bón lót kết hợp với Clorua đồng dạng vi lượng (1000g/ha).
- Công thức 3: Tưới chế phẩm 4kg/sào sau khi trồng kết hợp với Clorua
đồng (1000g/ha) dạng vi lượng.
- Công thức 4: Đối chứng (Phòng trừ theo nông dân).
Cách tiến hành: Trộn 4kg chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma hazianum
với 400kg phân chuồng hoai mục để 10-15 ngày sau đó bón vào hốc lấp đất nhẹ rồi trồng cây. Không sử dụng các loại thuốc trừ bệnh khác.
Phòng trừ theo nông dân được tiến hành như sau: Sau khi trồng 5-10 ngày tiến hành nhổ bỏ các cây bị bệnh, dặm tỉa vào các chỗ bị khuyết nhằm đảm bảo mật
độ. Thường xuyên ngắt tỉa là bị già, lá bệnh. * Chỉ tiêu theo dõi:
- Năng suất thực thu (tấn/ha) - Màu sắc, hình dạng bắp. - Độ chặt của bắp
- Chiều cao cây (cm) - Tỉ lệ bệnh.
- Số lá trên cây. - Khối lượng bắp (kg) - Hiệu quả phòng trừ (%) * Các công thức tính toán:
- Độ chặt của bắp được tính theo công thức:
P = G/(h1 x h2 x h3 x 0,52).
Trong đó: P – độ chặt của bắp, P<1 bắp rất chặt, P>1 bắp rất xốp. G – khối lượng trung bình bắp tính bằng gam.
h1, h2, h3 – đường kính 3 chiều tính bằng cm. 0,52 – hệ sốđiều chỉnh
3.4.2.6. Phương pháp khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma
hazinum đối với nấm gây bệnh trong điều kiện chậu vại
* Thí nghiệm: Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm R. solani và S. sclerotiorum bằng biện pháp xử lý hạt giống và xử lý
Trichoderma hazianum ở giai đoạn 2 lá mầm.
Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 3 chậu, mỗi chậu gieo 25 hạt cải bắp. Thí nghiệm được bố trí trên nền đất đã khử trùng.
Công thức 1: (Đối chứng): Ngâm hạt cải bắp trong dung dịch nấm gây bệnh 30 phút sau đó đem gieo.
Công thức 2: Ngâm hạt cải bắp trong dung dịch nấm gây bệnh rồi gieo đến khi cây được 2 lá mầm tiến hành xử lý nấm đối kháng Trichoderma hazianum.
Công thức 3: Ngâm hạt trong hỗn hợp nấm đối kháng Trichoderma hazianum và nấm gây bệnh trong vòng 30 phút sau đó đem gieo.
Công thức 4: Ngâm hạt cải bắp trong dung dịch nấm đối kháng Trichoderma hazianum 30 phút rồi đem gieo đến khi cây được 2 lá mầm tiến hành xử lý nấm gây bệnh.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi số hạt chết, cây chết ở mỗi công thức sau xử lý 7, 14, 24, 21 ngày, từ đó tính hiệu quả phòng trừ của nấm Trichoderma hazianum
trong phòng thí nghiệm theo công thức Abbott.
HQPT (%) = (B – N) x 100% / N
Trong đó: HQPT: Hiệu quả phòng trừ.
B: Số cây chết ở công thức không xử lý Trichodermahazianum
N: Số cây chết ở công thức xử lý Trichoderma hazianum sau thí nghiệm.
3.4.2.7. Khảo sát hiệu lực của một số thuốc hóa học phòng trừ bệnh lở cổ rễ hại
cải bắp ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khảo nghiệm thuốc BVTV
đồng ruộng diện hẹp do ngành BVTV quy định. Mỗi công thức thí nghiệm bố
trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc có diện tích 30m2. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ RCB. Nồng độ thuốc theo nồng độ khuyến cáo trên bao bì sản phẩm.
Các công thức thí nghiệm:
+ Công thức 1: Tropin top 325SC, nồng độ 0,09%. + Công thức 2: Valivithaco 3SC, nồng độ 0,125%. + Công thức 3: Vimix 13,1 SL, nồng độ xử lý 0,125%. + Công thức 4: TP – zep 18EC, nồng độ xử lý 0,125%. + Công thức 5: Đối chứng, xử lý bằng nước lã
Cây trồng thí nghiệm: Cây cải bắp (giống Sakata ) sau trồng khoảng 7 - 10 ngày. Phương pháp điều tra theo dõi:
Điều tra tỷ lệ bệnh các công thức thí nghiệm trước phun 1 ngày và sau phun 3, 7, 10 ngày
Mỗi ô thí nghiệm điều tra 5 điểm theo đường chéo góc, mỗi điểm điều tra 1 m2.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Hiệu lực phòng trừ của các loại thuốc hóa học thử nghiệm sau phun 3, 7, 10 ngày (%).
- Hiệu lực phòng trừ của các loại thuốc hóa học được tính toán theo công thức Henderson-Tilton:
HLPT (%) = (1 - Ta x Cb ) x 100 Tb x Ca
Trong đó: Ta: Tỷ lệ bệnh (hoặc chỉ số bệnh) ở công thức xử lý sau phun Tb: Tỷ lệ bệnh (hoặc chỉ số bệnh) ở công thức xử lý trước phun Ca: Tỷ lệ bệnh (hoặc chỉ số bệnh) đối chứng sau phun
Cb: Tỷ lệ bệnh (hoặc chỉ số bệnh) đối chứng trước phun
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝSỐ LIỆU
Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Irristat 5.0.
Các giá trị trung bình của các nghiệm thức được so sánh bằng F, t, LSD ở
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN BỆNH HẠI CÂY CẢI BẮP VÀ DIỄN BIẾN PHÁT SINH CỦA BỆNH LỞ CỔ RỄ VÀ THỐI HẠCH
4.1.1. Thành phần và mức độ phổ biến bệnh hại cây cải bắp vụđông năm 2015 và vụ xuân năm 2016 tại Đông Anh, Hà Nội
Vụ đông và vụ xuân là 2 vụ trồng rau chính của Đông Anh. Vụ đông năm 2015 diễn ra với thời tiết có rét xen kẽ lẫn mưa nhỏ nhiệt độ trung bình thấp dao động từ 16 – 210C tạo điều kiện thuận lợi cho cải bắp phát triển. Bên cạnh đó cũng tạo điều kiện cho nấm bệnh phát sinh, gây hại. Cải bắp có bộ rễăn nông, chỉ tập trung chủ yếu trong tầng đất màu. Bộ lá khá phát triển, to bản nhưng mỏng, nên chịu hạn kém và dễ
bị sâu bệnh gây hại. Đặc biệt trong vụđông xuân (từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau) tạo điều kiện cho các tác nhân gây hại phát triển mà đặc biệt là nấm gây bệnh.
Chính vì vậy, việc điều tra và xác định thành phần bệnh nấm hại cải bắp là việc có ý nghĩa rất quan trọng để làm cơ sở cho công tác nghiên cứu trong bảo vệ
thực vật, từ đó có thể xây dựng được phương pháp phòng trừ hiệu quả giúp tăng năng suất và chất lượng rau.
Tiến hành điều tra thành phần bệnh nấm hại rau cải bắp vụ đông năm 2015 và vụ xuân 2016 tại Đông Anh, Hà Nội.
Kết quảđiều tra bệnh hại cây cải bắp tại Đông Anh, Hà Nội được trình bày ở
bảng 4.1.
Bảng 4.1. Thành phần và mức độ phổ biến của các bệnh hại cây cải bắp vụđông năm 2015 và vụ xuân 2016 tại Đông Anh, Hà Nội
TT Tên bệnh Tên khoa học V Mức độ phổ biến
ụĐông 2015 Vụ xuân 2016 1 Đốm vòng Alternaria brassicae +++ ++ Alternaria brassicicola ++ ++ 2 Lở cổ rễ Rhizoctonia solani ++ + 3 Thối nâu + + 4 Thối hạch Sclerotina sclerotiorum ++ +++
5 Thối ướt Erwinia carotovora +++ +
6 Sưng rễ Plasmodiophora brassicae + +
7 Sương mai Peronohazianumora
brassicae + 8 Vàng lá Sinh lý + Ghi chú: + : Bệnh ít phổ biến (TLB ≤ 5%) ++ : Bệnh khá phổ biến (TLB: 5 - 25%) +++ : Bệnh phổ biến (TLB ≥ 25%)
Qua bảng 4.1 cho thấy trong 2 vụ (vụđông năm 2015 và vụ xuân năm 2016) ghi nhận sự xuất hiện gây hại của 6 loại nấm, 01 loại vi khuẩn và 01 bệnh sinh lý. Trong đó bệnh xuất hiện ở mức độ khá phổ biến đến phổ biến trong cả hai vụ là bệnh đốm vòng do 2 loại nấm A. brassicae, A. brassicicola và bệnh thối hạch do nấm Sclerotinia sclerotiorum gây ra. Bệnh thối nhũn cải bắp xuất hiện cao ở vụ đông năm 2015 so với mức thấp ở vụ xuân năm 2016 có khả năng do điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao ở vụ đông năm 2015 thích hợp cho bệnh phát triển hơn là
điều kiện nhiệt độ thấp ở vụ xuân 2016. Các bệnh sưng rễ, sương mai, lở cổ rễ ghi nhận xuất hiện ở mức thấp. Bệnh lở cổ rễ mức độ xuất hiện khá phổ biến ở vụđông năm 2015 so với vụ xuân 2016.
4.1.2. Đặc điểm điểm triệu chứng của một số bệnh hại cây cảibắp
Qua điều tra cho thấy không chỉ ghi nhận được sự đa dạng về vị trí gây hại khác nhau của mỗi loại tác nhân gây bệnh mà còn ghi nhận sự khác nhau về vị trí gây hại của cùng một loại tác nhân gây bệnh trên cây Cải bắp, từ các vị trí gây hại này chúng thể hiện các triệu chứng khác nhau để phân biệt. Vị trí gây hại của mỗi loại các mỗi loại tác nhân gây bệnh được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Vị trí gây hại của các tác nhân gây bệnh trên cây cải bắp tại
Đông Anh – Hà Nội STT Tên bệnh Tác nhân gây bệnh Bgây hộ phận
ại Giai đoạn bắt đầu gây hại Triệu chứng gây hại Nấm bệnh 1 Đốm vòng Alternaria brassicae Lá Trải lá bàng Đốm vòng màu nâu xám
2 Alternaria brassicicola Đốm vòng màu
đen bồ hóng 3 Sưng rễ Plasmodiophora brassicae Rễ Cây con Sưng rễ
4 Sương mai Peronohazianumora
brassicae Lá Trbàng ải lá Cháy lá
5 Thối hạch Sclerotina sclerotiorum Bắp Cuốn bắp Thối hạch 6 Lở cổ rễ Rhizoctonia solani Rễ Cây con Sưng rễ
Thối nâu Bắp Cuốn băp Lở cổ rễ
Vi khuẩn
7 Thối ướt Erwinia carotovora Bắp hoThu ạch Thối nhũn bắp
Sinh lý
Qua bảng 4.2 và hình 4.1 cho thấy ở giai đoạn cây con: cải bắp chịu gây hại chủ yếu của 2 loại nấm Rhizoctonia solani và Plasmodiophora brassicae, đây là những nguyên nhân chính gây chết rạp cây con trên đồng ruộng. Nấm R. solani có triệu chứng đặc trưng nhất là rễ, cổ rễ và gốc thân sát mặt đất bị thâm đen sau đó lan rộng ra rất nhanh bao quanh cổ rễ làm cho cây khô héo và đổ gục.