Có nhiều tác giả đã nghiên cứu và đề xuất áp dụng một số biện pháp phòng trừ như: chọn tạo giống chống chịu, canh tác, chế phẩm sinh học, thuốc hóa học,....
Đối với biện pháp chọn tạo giống chống bệnh các nhà nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp lai tạo, chọn lọc cá thể,...để chọn tạo ra các giống cây trồng có khả
năng kháng bệnh cao.
Áp dụng các biện pháp canh tác như: trước khi gieo trồng cần tiêu nước, trồng cây với mật độ khoảng cảnh thích hợp để tránh dẫn đến độ ẩm cao là điều kiện thích hợp cho nấm phát sinh, phát triển. Tiến hành dọn sạch tàn dư cây bệnh ra khỏi đồng ruộng cũng có tác dụng làm giảm số lượng nguồn bệnh trong đất đồng thời tiến hành luân canh với các cây trồng khác họ hoặc ít mẫn cảm với nấm bệnh cũng có tác dụng giảm mức độ gây bệnh.
Tuy nhiên để có hiệu quả phòng trừ nhanh các nhà nghiên cứu đã sử dụng các loại thuốc hóa học. Các loại thuốc trừ nấm Methyl thiophanate, chlorothalanil...
được sử dụng một cách hợp lý đều có tác dụng phòng trừ bệnh do nấm R.solani gây ra (Janice, 2008).
Ngày nay, với xu thế sản xuất theo hướng an toàn vì vậy con người đã chú trọng nhiều đến việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc sinh học để phòng trừ
dịch hại cây trồng. Các sản phẩm này có nhiều ưu điểm như an toàn với môi trường, vật nuôi và con người, không tạo ra tính kháng và các nòi, các chủng mới, đồng thờii đảm bảo tính cân bằng trong hệ sinh thái.
Nhiều nghiên cứu được tiến hành ở các nước trên thế giới như Anh, Pháp, Mỹ,… đã sử dụng các loài sinh vật đối kháng trong đó có loài nấm Trichoderma
hazianum.được đánh giá rất cao.
Nấm Trichoderma hazianum. một loại nấm sống hoại sinh trong đất và trên các tàn dư thực vật, thuộc hộ Hyphales, lớp nấm bất toàn (Fungi imperfecti). Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma hazianum. đối với nấm gây bệnh chủ yếu là ký sinh dẫn đến ức chế sợi nấm hoặc tạo ra các chất kích kháng có hoạt tính sinh học cao ức chế phát triển của nấm gây bệnh.
Ngoài ra nấm này còn có thể tiết ra các loại men gây biến đổi thành tế bào sợi nấm gây bệnh. Theo tác giả Chet and Baker (1981) nấm Trichoderma hazianum. còn thể hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh dinh dưỡng, nơi cư trú với nấm gây bệnh làm ức chế sự sinh trưởng, phát triển của chúng.
Kết quả nghiên cứu của Strashnov (1985) được thực hiện ở ngoài đồng cho thấy nấm đối kháng Trichoderma hazianum khi phun vào đất nhiễm nấm
Rhizoctonia solani hoặc phun lên cây, quả sẽ giảm tỷ lệ thối quả từ 43 – 83%. Khi trộn Trichoderma hazianum với đất bị nhiễm nấm tự nhiên sẽ có tác dụng giảm khả
năng lây nhiễm của bệnh 86%, giảm tỉ lệ thối quả từ 27 – 51%.
Ngoài tác dụng ức chế nấm bệnh phát triển, nấm đối kháng Trichoderma
sp. còn có tác dụng kích thích cây trồng sinh trưởng phát triển. Qua các kết quả
nghiên cứu của nhà khoa học nghiên cứu của nhiều nhà khao học thì cơ chế của sự
tác động này có thể do nấm Trichoderma sp. ức chế các nấm thứ yếu trong vùng rễ
cây, sản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng hoặc các Vitamin, phân giải thành các chất dễ hấp thụ cho cây trồng. Do vậy dùng chế phẩm Trichoderma sp. có tác dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỉ lệ cây bệnh bệnh, giúp cây tăng sức đề kháng, đối với vi sinh vật gây bệnh, có tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây trồng. (Elad et al., 1980; Harman et al., 2004).
Nấm Trichoderma viride có hiệu lực phòng trừ bệnh rất cao đối với nấm
Rhizoctonia solani (Lê Lương Tề, 2007). Khảo sát hiệu lực của nấm đối kháng
Trichoderma viride với các isolate nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ trên môi trường nhân tạo PGA, cho thấy khi loài nấm đối kháng Trichoderma viride có mặt trước nấm gây bệnh thì bản thân nó có khả năng chiếm chỗ, cạnh tranh, ức chế và tiêu diệt nấm Rhizoctonia solani (Đỗ Tấn Dũng, 2007).
Tiến hành luân canh cây trồng cạn với cây lúa nước từ 2-3 năm, cày bừa kỹ,
để ải, bón vôi, tiêu huỷ tàn dư cây bệnh, lên luống cao dễ thoát nước, không gieo trồng quá sâu. Có thể dùng một số thuốc hoá học để phòng trừ bệnh lở cổ rễ như: Ridomil gold 72WP, Topsin 70WP, Rovral,… (Vũ Triệu Mân, 2007).
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Bệnh lở cổ rễ và thối hạch hại cây cải bắp.
3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại: Các vùng trồng cải bắp tại Đông Anh, Hà Nội và Bộ môn Bệnh cây – Khoa Nông học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 3/2016.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Mẫu bệnh nấm gây hại cây cải bắp thu thập từ ngoài đồng ruộng.
- Giống cải bắp được trồng phổ biến là Sakata và Newtop
- Môi trường nuôi cấy: WA, PGA, PCA.
- Nấm đối kháng Trichoderma hazianum; chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma hazianum (3,2.109cfu/gam); Dạng vi lượng của Clorua
đồng 0,05 mM; các thuốc trừ nấm Trobin top 325SC, Valivithaco 3SC; Vimex 13,1SL; TP – zep 18EC.
- Các dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm như hộp petri, que cấy nấm, tủđịnh ôn, phòng nuôi cấy nấm, các loại cốc thủy tinh, ống đong, bình đựng nước, nồi hấp, tủ lạnh, kính hiển vi quang học,...
3.3. NỘI DUNG
- Xác định thành phần bệnh hại trên cây cải bắp vụ đông năm 2015 và vụ
xuân năm 2016.
- Giám định bệnh nấm gây bệnh lở cổ rễ và thối hạch hại cây cải bắp ở một số vùng sản xuất rau an toàn tập trung tại Đông Anh – Hà Nội.
- Điều tra diễn biến bệnh hại trên cây cải bắp tại một số ruộng đại diện ở Đông Anh vào vụđông xuân năm 2014 – 2015; vụđông năm 2015; vụ xuân 2016.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của 2 loài nấm gây hại Rhizoctonia solani
và Sclerotinia sclerotiorum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp kĩ thuật canh tác tới khả năng tồn tại và phát triển của nấm gây bệnh lở cổ rễ và thối hạch.
- Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani bằng chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma hazianum trong phòng thí nghiệm.
- Khảo sát hiệu lực phòng trừ nấm hại cải bắp của một số thuốc hóa học ngoài đồng ruộng; chế phấm đối kháng Trichoderma hazianum và Clorua đồng dạng vi lượng trong chậu vại (Xử lý hạt giống) và ngoài động ruộng.
- Thử nghiệm biện pháp phòng trừ bệnh thối thân hại cây cải bắp bằng sử
dụng thuốc hóa học.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp điều tra bệnh nấm hại cải bắp
Điều tra thành phần bệnh hại
Điều tra theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2010, điều tra 10 điểm ngẫu nhiên nằm trên đường chéo của khu vực điều tra. Điểm điều tra cách bờ ít nhất 2 m. Điều tra theo định kỳ 7 ngày một lần.
+ Bệnh toàn cây: 10 thân ngẫu nhiên/điểm + Bệnh trên rễ: 10 cây ngẫu nhiên/điểm + Bệnh trên lá: Đếm số lá bị bệnh trên
Quan sát triệu chứng điển hình của bệnh, đánh giá mức độ phổ biến của bệnh: Mức độ phổ biến của bệnh:
+ : Bệnh ít phổ biến (TLB ≤ 5%) ++ : Bệnh khá phổ biến (TLB 5 - 25%) +++ : Bệnh phổ biến (TLB ≥ 25%)
Điều tra diễn biến bệnh bệnh lở cổ rễ và thối hạch:
Đối với bệnh thối hạch, lở cổ rễ: Điều tra định kỳ 7 ngày 1 lần, theo phương pháp năm điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 50 cây.
Tính tỷ lệ (%): A + Tỷ lệ bệnh (%) = --- x 100 B A: Số lá (cây) bị bệnh B: Số lá (cây) điều tra
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
Phân lập, nuôi cấy, giám định nguyên nhân gây bệnh hại theo tài liệu của Mathur and Olga (1999)
3.4.2.1. Phân lập và nhân nuôi nấm gây bệnh lở cổ rễ và thối hạch trên môi trường
nhân tạo
Phương pháp đểẩm
Sau khi điều tra thu thập được mẫu bệnh (lá, thân, gốc) ngoài đồng ruộng chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, rửa sạch đất cát, cắt thành mẫu thích hợp
để trong hộp petri có giấy ẩm, đểở nhiệt độ thích hợp sau 2 – 3 ngày, đem kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định sơ bộ tác nhân gây bệnh.
Các môi trường nuôi cấy
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường nhân tạo PGA, PCA, WA.
+ Môi trường PGA (Potato glucose agar):
Thành phần: Khoai tây: 200g Agar: 20g
Đường glucose: 20g Nước cất: 1000ml
Điều chế môi trường: Khoai tây gọt sạch vỏ, thái lát mỏng, đem đun sôi với nước cất 30 phút, sau đó lọc bằng vải mỏng qua phễu. Cho thêm nước cất đủ
1000ml đem đun sôi lại.
Cho lần lượt Agar, đường khuấy đều cho tan hết, sau đó đổ môi trường vào bình tam giác, hay ống nghiệm có đậy nút bạc (bình tam giác, ống nghiệm, hộp Petri đã được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1800C trong vòng 2 giờ). Sau
đó đem khử trùng trong nồi hấp ở áp suất 1.5 amt (1210C) trong 30 phút.
+ Môi trường PCA:
Thành phần: Khoai tây: 100g Agar: 20g
Cà rốt: 100g Nước cất: 1000ml
+ Môi trường WA
Thành phần: Agar: 20g Nước cất: 1000ml
Cách điều chế: Đun tan Agar trong nước cất sau đó khử trùng. Cách làm tương tự như các môi trường trên.
Phương pháp phân lập nấm
Phương pháp lấy mẫu: lấy mẫu lá, thân, rễ bệnh mới, điển hình cho bệnh cần nghiên cứu. Sau khi lấy mẫu cho vào túi nilon có lót giấy thấm ẩm, đem về phòng phân lập luôn hoặc bảo quản ở nhiệt độ 40C trong tủ lạnh.
Chọn những mẫu bệnh mới, vết bệnh điển hình sau đó rửa sạch. Chuẩn bị
dụng cụ: dao, panh, giấy thấm vô trùng, cốc thủy tinh đựng cồn (ethanol), cồn (ethanol) 70%, nước cất, 3 đĩa đựng nước cất, bàn thái. Khử trùng buồng cấy bằng cồn (ethanol) 70%.
Cắt mảnh mô bệnh thích hợp sau đó khử trùng bề mặt bằng cách dùng giấy mềm đã nhúng cồn (ethanol) 70% lau mặt lá hoặc bằng cách nhúng nhanh vào cồn (ethanol, rửa lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng.
Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ 1 – 3 mm (chứa cả
phần mô bệnh và mô khỏe), sau đó dùng panh vô trùng đặt lên môi trường nghèo dinh dưỡng (như WA, để nấm phát triển bào tử) hoặc môi trường chọn lọc, đặt những miếng cấy gần mép đĩa.
Bọc đĩa lại bằng nilon gói thực phẩm và đểởđiều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp để bào tử nấm hình thành. Theo dõi và kiểm tra sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh.
Sau khi nấm mọc, tiến hành cắt đầu sợi nấm cấy truyền sang các đĩa khác cho tới khi thu được nguồn nấm thuần khiết. Quan sát đặc điểm hình thái, màu sắc sợi nấm.
3.4.2.2. Nghiên cứu loài nấm gây bệnh lở cổ rễ và thối hạch
Chọn những cây bắp cải khỏe không bị bệnh. Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (isolate) đã nuôi cấy được trên môi trường rồi tưới hoặc phun trực tiếp lên cây
Giống cải bắp sử dụng để lây bệnh: Newtop (lai F1) chịu nhiệt.
+ Đối với bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani) tiến hành lây bệnh ở cổ rễ với 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 cây. Sử dụng cây bắp cải gia
đoạn cây con sau trồng từ 7-10 ngày. CT 1: Có sát thương CT2: Không sát thương
+ Đối với bệnh thối hạch (Sclerotinia sclerotiorum) cũng tiến hành lây bệnh như sau:
Sử dụng cây cải bắp giai đoạn trải lá bàng.
Lây bệnh trên lá với 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 5 cây, mỗi cây lây 10 vết.
CT 1: Có sát thương CT 2: Không sát thương
Lây bệnh ở cổ rễ gồm 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 10 cây.
CT 1: Có sát thương CT 2: Không sát thương Chỉ tiêu theo dõi:
+ Theo dõi trong 7 ngày
+ Ngày phát bệnh, thời kì tiềm dục + Quan sát và ghi nhận các triệu chứng
+ Đếm số vết biểu hiện triệu chứng bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%)
3.4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của
nấm Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum.
Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗđục 5mm) trên các môi trường PCA, PGA, WA.
Đối với mỗi loài nấm bệnh tiến hành thí nghiệm với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. Theo dõi đến khi nấm mọc kín đĩa.
CT 1: Cấy nấm bệnh trên môi trường PGA CT 2: Cấy nấm bệnh trên môi trường PCA CT 3: Cấy nấm bệnh trên môi trường WA Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm).
3.4.2.4. Khảo sát khả năng phòng trừ nấm Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia
solani bằng nấm đối kháng Trichoderma hazianum
Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri.
Công thức 1: Cấy nấm Trichoderma, sau 24 giờ cấy nấm gây bệnh Công thức 2: Cấy nấm gây bệnh, sau 24 giờ cấy nấm Trichoderma
Công thức 3: Cấy nấm Trichoderma đồng thời với nấm gây bệnh
Công thức 4: Đối chứng, cấy nấm gây bệnh và cấy nấm Trichoderma riêng biệt. Chỉ tiêu theo dõi:
+ Đo đường kính tản nấm của nấm Trichoderma và nấm gây bệnh ở các công thức.
Đánh giá hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm gây bệnh theo công thức Abbott:
C - T
HLĐK (%) = --- x 100 C
Trong đó:
C: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng
T: đường kính tản nấm ở công thức có xử lý nấm Trichoderma hazianum.
3.4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma
hazianum kết hợp với Clorua đồng dạng vi lượng đến sự phát triển của nấm gây
bệnh lở cổ rễ, thối hạch trên cây cải bắp.
* Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại tại xã Tiên Dương – huyện Đông Anh – Hà Nội gồm 4 công thức, mỗi công thức là 1 ô có diện tích 30 m2 có dải bảo vệ xung quanh. Tổng diện tích làm thí nghiệm là 420m2.
- Công thức 1: 4kg chế phẩm/ sào ủ với 400kg phân chuồng trước khi bón lót. (trong khi trồng).
- Công thức 2: 4kg chế phẩm/ sào ủ với phân chuồng trước khi bón lót kết hợp với Clorua đồng dạng vi lượng (1000g/ha).
- Công thức 3: Tưới chế phẩm 4kg/sào sau khi trồng kết hợp với Clorua
đồng (1000g/ha) dạng vi lượng.
- Công thức 4: Đối chứng (Phòng trừ theo nông dân).
Cách tiến hành: Trộn 4kg chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma hazianum
với 400kg phân chuồng hoai mục để 10-15 ngày sau đó bón vào hốc lấp đất nhẹ rồi trồng cây. Không sử dụng các loại thuốc trừ bệnh khác.
Phòng trừ theo nông dân được tiến hành như sau: Sau khi trồng 5-10 ngày tiến hành nhổ bỏ các cây bị bệnh, dặm tỉa vào các chỗ bị khuyết nhằm đảm bảo mật
độ. Thường xuyên ngắt tỉa là bị già, lá bệnh. * Chỉ tiêu theo dõi:
- Năng suất thực thu (tấn/ha) - Màu sắc, hình dạng bắp. - Độ chặt của bắp
- Chiều cao cây (cm) - Tỉ lệ bệnh.
- Số lá trên cây. - Khối lượng bắp (kg) - Hiệu quả phòng trừ (%) * Các công thức tính toán:
- Độ chặt của bắp được tính theo công thức:
P = G/(h1 x h2 x h3 x 0,52).
Trong đó: P – độ chặt của bắp, P<1 bắp rất chặt, P>1 bắp rất xốp. G – khối lượng trung bình bắp tính bằng gam.
h1, h2, h3 – đường kính 3 chiều tính bằng cm. 0,52 – hệ sốđiều chỉnh
3.4.2.6. Phương pháp khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma
hazinum đối với nấm gây bệnh trong điều kiện chậu vại
* Thí nghiệm: Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma hazianum đối