Thường sử dụng phương pháp mổ khám toàn diện. Mổ khám chó quan sát các tổn thương đại thể và tiến hành chụp ảnh các tổn thương điển hình.
Phương pháp mổ khám bao gồm các bước sau:
- Bước 1: Đặt chó nằm trên bàn mổ hoặc tấm ván hay túi nilon đã chuẩn bị trước, dùng dao cắt da và các cơ trong nách tới khớp xương bả vai và kéo dài đến
cằm cả hai bên, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho chó nằm tư thế nằm ngửa.
- Bước 2: Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng để bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
- Bước 3: Quan sát dịch chứa trong xoang ngực và xoang bụng, kiểm tra những biến đổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kích thước, hình dáng.
- Bước 4: Cắt tách lưỡi, thực quản, khí quản, phổi, cuối cùng cắt đứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành. Kéo toàn bộ hệ thống dạ dày ruột ra ngoài kiểm tra sau cùng tránh gây nhiễm bẩn các tổ chức khác. Lấy các tổ chức trong cổ, ngực rửa nước sạch trước khi kiểm tra chi tiết bên ngoài.
- Bước 5: Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim.
- Bước 6: Kiểm tra hạch amidan, rạch thanh quản, khí quản, phế quản, phế nang phổi kiểm tra bên trong về màu sắc và độ đàn hồi.
- Bước 7: Rạch kiểm tra chất chứa bên trong thực quản, gạt bỏ chất chứa kiểm tra niêm mạc.
- Bước 8: Lấy gan, mật, lá lách ra để kiểm tra về màu sắc, kích thước, độ cứng mềm, ký sinh trùng, các ổ viêm, hoại tử, ổ áp xe. Rạch bổ gan và lách kiểm tra có bị sưng, tách túi mật kiểm tra niêm mạc.
- Bước 9: Tách vỏ thận, kiểm tra bên ngoài và bổ đôi kiểm tra bên trong thận, kiểm tra bóng đái.
- Bước 10: Kiểm tra hệ thống hạch lâm ba trong cơ thể về màu sắc, kích thước và độ đàn hồi, bổ đôi kiểm tra bên trong và có biểu hiện sưng hay không.
- Bước 11: Rạch kiểm tra bên trong hệ thống tiêu hóa theo thứ tự từ dạ dày tới hậu môn loại bỏ chất chứa quan sát bề mặt niêm mạc đặc biệt chú ý tới: chất chứa, dịch, màu sắc, điểm hoại tử, xuất huyết.
- Bước 12: Lấy các cơ quan, tổ chức làm tiêu bản vi thể.
3.5.6. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản tẩm đúc bằng Parafin, cắt dán tiêu bản và nhuộm Hematoxylin – Eosin. Phương pháp bao gồm các bước sau:
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: lọ chứa formol 10%, dao, kéo, panh kẹp, cốc
đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 370C, máy cắt
microtom, nước ấm 48 - 520C, xylen, Paraffin, thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin…
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là lách, hạch màng treo ruột, ruột, dạ dày, gan thận, não, phổi.
Cố định bệnh phẩm:
- Mục đích: giết chết tổ chức.
- Cách tiến hành: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch Formol 10% (thể tích Formol gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong Formol). Để sau 7 -10 ngày là có thể dùng được (cắt mẫu bệnh phẩm không thấy máu chảy ra là được).
Vùi bệnh phẩm:
- Mục đích: tạo chất nền cho tổ chức dễ cắt. - Tiến hành các bước sau:
Rửa Formol: lấy tổ chức ra khỏi bình Formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 -5 mm cho vào khuôn đúc bằng nhựa. Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h để rửa sạch Formol.
Khử nước và khử cồn
- Mục đích: khử hết nước và cồn trong tổ chức.
- Ngâm lần lượt các miếng tổ chức trong các bình dung dịch sau: Cồn I: 3 giờ.
Cồn II: 3 giờ. Cồn III: 4 giờ Cồn IV: 12 giờ. Xylen I : 4 giờ. Xylen II: 4 giờ. Xylen III: 12 giờ.
Khử xylen
- Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức, để paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
- Ngâm lần lượt các miếng tổ chức trong hệ thống paraffin ở 560C Paraffin I: 6 giờ.
Paraffin II: 6 giờ. Paraffin III: 12 giờ.
Đúc block
- Mục đích: để vùi miếng tổ chức trong môi trường paraffin thuần nhất tạo thành 1 thể thống nhất.
- Đúc block: đặt miếng bệnh phẩm vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh Paraffin lỏng vào khuôn block. Sau đó đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đông cứng, đặc chắc là được. Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn rồi gắn nhãn để tránh nhầm lẫn.
Cắt, tãi mảnh
Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
Tãi mảnh: sau khi cắt mảnh dùng panh kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho
sang nước ấm 48 – 520C rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến
kính. Để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô, nhuộm tiêu bản bằng phương pháp
nhuộm Hematoxylin – Eosin.
Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau:
- Bước 1: Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc. Xylen I : 10 phút.
Xylen II : 10 phút. Xylen III : 10 phút.
- Bước 2: Khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc . Cồn 1000C : 2 lần (mỗi lần 1 phút).
Cồn 950C : 1 lần. Cồn 700C : 1 lần. Cồn 500C : 1 lần.
- Bước 4: Nhuộm Hematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản. Để khoảng 3 – 5 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản màu xanh tím là được.
+ Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
+ Nếu đậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960C + HCL 1%) trong
30 giây.
Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
- Bước 5: Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương): nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 – 5 phút, sau đó rửa nước chảy 5 – 10 phút cho hết Eosin thừa.
- Bước 6: Tẩy nước.
+ Cho tiêu bản qua ba lọ cồn tuyệt đối, mỗi lọ 1 phút. - Bước 7: Tẩy cồn, làm trong tiêu bản.
Cho tiêu bản lần lượt đi qua ba lọ xylen I, II, III trong thời gian 1 giây. Sau đó
cho tiêu bản vào lọ xylen đã để sẵn trong tủ ấm 370C trong 2 phút.
Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
Đánh giá kết quả: đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.
Trong quá trình mổ khám tiến hành lấy mẫu mang về phòng thí nghiệm làm tiêu bản vi thể. Các mẫu thu nhận gồm hạch lâm ba, phổi, gan, lách, dạ dày, ruột, thận, tim, não. Mẫu tổ chức được ngâm bảo quản ở formol 10% để làm tiêu bản vi thể.