Phản ứng RT-PCR và phản ứng định lượng virus real-time RT-PCR (de Wit, 2000). Các phương pháp này đều có ưu điểm và nhược điểm riêng về độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian kiểm tra và giá thành của sản phẩm. Phương pháp định lượng realtime RT-PCR được phát triển và ứng dụng chẩn đoán và được áp dụng cho nhiều loại mầm bệnh gây bệnh trong thú y. Phương pháp này cho phép định lượng virus gây bệnh với độ nhạy rất cao; tuy nhiên, phương pháp này đôi khi cũng có những mặt giới hạn khi các chủng IBV thay đổi hình thành các chủng virus mới (Callison et al., 2006). Phương pháp nhân gen (RT-PCR) không thích hợp để xác định typ virus gây bệnh, việc định typ gây bệnh thường dựa trên cơ sở so sánh trình tự các Nucleotit của gen S trong cấu trúc của IBV.
2.3.4.1. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR)
Virus, khi được phân loại theo bản chất di truyền thường được phân thành 2 loại chính là virus có cấu trúc di truyền là DNA (DNA virus) và virus có cấu trúc di truyền là RNA (RNA virus). Dựa trên cấu trúc này mà người ta phát triển các kỹ thuật PCR khác nhau để tập trung phát hiện từng loại virus dựa trên cấu trúc di truyền đích là DNA hay RNA. Để phát hiện và nghiên cứu virus có cấu trúc di truyền là RNA (IBV là một RNA virus), người ta đã phát triển một kỹ thuật có tên là RT-PCR hay PCR phiên mã ngược (Reverse transcriptase - PCR).
Phản ứng RT-PCR cho khuếch đại DNA từ RNA. Như vậy RT-PCR gồm có 2 giai đoạn: Ban đầu là RT (phiên mã ngược), dưới tác dụng của RNA
polymerase, RNA được phiên mã ngược thành cDNA - DNA bổ sung (complemetary DNA); sau đó là PCR, cDNA được khuếch đại bởi PCR thành sản phẩm cuối cùng. Quá trình phiên mã ngược từ RNA thành cDNA thường được diễn ra ở nhiệt độ 42oC và nhiệt độ này không phá huỷ cấu trúc bậc 2 của RNA. Sau đó, người ta sẽ thu lấy cDNA và tiến hành một phản ứng PCR. Hiện nay trong chẩn đoán nhanh, người ta thường tiến hành phản ứng RT-PCR 1 bước hay 1 ống. Nghĩa là cả 2 giai đoạn RT và PCR đều được thực hiện ngay trong cùng một ống phản ứng. Điều này giúp cho phản ứng diễn ra được an toàn, tránh được tạp nhiễm chéo khi thu cDNA để tiến hành tổng hợp DNA trong phản ứng PCR. Hơn nữa phản ứng RT-PCR một bước cũng giúp cho việc rút ngắn thời gian trong chẩn đoán bệnh. Hiện nay, trong nghiên cứu virus có cấu trúc RNA, khi giải trình tự gen (sequencing) người ta vẫn tiến hành RT-PCR 2 bước, nhằm thu được lượng cDNA nhiều phục vụ cho mục đích giải trình tự.
Các bước còn lại của phản ứng RT-PCR cũng giống như của PCR, nghĩa là sau khi phản ứng kết thúc, phải tiếp tục dùng phương pháp điện di để đọc và phân tích kết quả. Phương pháp RT-PCR thường được sử dụng để chẩn đoán phát hiện các virus IB, Gumboro (IBDV), Newcastle (NDV), Cúm gia cầm, Dịch tả lợn (CSFV), Lở mồm long móng (FMDV)…
Bên cạnh kỹ thuật PCR và RT-PCR còn có một số kỹ thuật PCR khác rất được phổ biến trong việc nghiên cứu các vi sinh vật, đặc biệt là virus. Thực tế các kỹ thuật này cũng có bản chất là phản ứng PCR thông thường, nhưng có những sự thay đổi nhằm làm tăng hiệu quả và độ đặc hiệu của phản ứng:
Phản ứng PCR khởi đầu nhiệt độ cao (Hot-start PCR): Hot-PCR bắt đầu: Đây là một kỹ thuật làm giảm sự khuếch đại không đặc hiệu trong giai đoạn đầu của PCR. Nó có thể được thực hiện bằng cách làm nóng các thành phần phản ứng tới nhiệt độ nóng chảy (ví dụ, 95°C) trước khi bổ sung polymerase vào phản ứng . hệ thống enzyme chuyên biệt đã được phát triển để ức chế hoạt động của polymerase ở nhiệt độ phòng, hoặc bằng cách gắn một kháng thể hoặc bởi sự hiện diện của chất ức chế đồng hóa trị ràng buộc mà nó chỉ phân ly sau một bước kích hoạt ở nhiệt độ cao. Phản ứng PCR khởi đầu nhiệt độ cao/kết thúc nhiệt độ lạnh được thực hiện với các polymerase lai ghép mới bất hoạt ở nhiệt độ phòng và ngay lập tức được kích hoạt ở nhiệt độ kéo dài.
Phản ứng PCR multiplex (nhiều đích): bao gồm tập hợp nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để sản xuất sản phẩm PCR (amplicon) có kích
thước khác nhau đặc hiệu đối với các chuỗi DNA khác nhau. Bằng cách tập trung vào các nhiều gen đích cùng một lúc, thông tin bổ sung có thể thu được từ một xét nghiệm duy nhất mà nếu không sẽ đòi hỏi thực hiện nhiều thời gian và thuốc thử hơn để thực hiện. Nhiệt độ bắt cặp cho mỗi bộ mồi phải được tối ưu hóa để hoạt động chính xác trong một phản ứng duy nhất, và kích thước sản phẩm PCR, nghĩa là, chiều dài theo cặp ba zơ của chúng, phải khác nhau, đủ để hình thành các vạch sản phẩm khác nhau khi quan sát trên điện di. Từ phản ứng PCR, người ta cũng phát triển tiếp thanh phản ứng multiplex RT-PCR với nguyên tắc tương tự. Kỹ thuật này đã được sử dụng rất nhiều trong nghiên cứu virus đặc biệt là những virus có bộ gen gồm nhiều mảnh như virus cúm A/H5N1: Bằng kỹ thuật này, người ta có thể tạo lập nên một phản ứng PCR để phát hiện cúm A, gen H5 và gen N1; hoặc dùng kỹ thuật này để phát hiện sự đồng nhiễm hoặc phân biệt các virus khác nhau trên cùng một mẫu bệnh phẩm, ví dụ như virus Newcastle và virus H5N1, hoặc phân biệt lợn mắc virus PRRS dòng châu Âu hay châu Mỹ.
Phản ứng Nested PCR: Nested PCR: phản ứng này làm tăng sự đặc hiệu khuếch đại DNA, bằng cách giảm nhiễu do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu. Hai bộ mồi được sử dụng trong hai phản ứng PCR liên tiếp. Trong phản ứng đầu tiên, một trong những cặp mồi được sử dụng để tạo ra sản phẩm DNA, trong đó ngoài các mục tiêu dự định, vẫn còn có thể bao gồm các đoạn DNA không đặc hiệu cũng được khuếch đại. Các sản phẩm DNA thu được trong phản ứng thứ nhất sau đó được sử dụng trong một PCR thứ hai với một cặp mồi sẽ gắn vào vị trí khác hoàn toàn hoặc một phần và định vị ở vị trí đầu 3'của mỗi mồi sử dụng trong phản ứng đầu tiên. Nested PCR thường thu được nhiều thành công trong việc khuếch đại một cách đặc hiệu đoạn DNA dài hơn so với phương pháp PCR thông thường, nhưng nó đòi hỏi kiến thức chi tiết hơn về các trình tự đích. Phương pháp này cũng thường được sử dụng trong chẩn đoán xét nghiệm, cụ thể là hiện nay được dung để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV – White Spot Syndrome Virus).
Phản ứng PCR Touch down (Step down PCR): Thực chất đây là một biến thể của PCR là nhằm mục đích giảm nhiễu không đặc hiệu bằng cách hạ dần dần nhiệt độ bắt cặp khi các chu trình nhiệt PCR đang diễn ra. Nhiệt độ bắt cặp ở các chu kỳ ban đầu thường là một vài độ (3-5°C) cao hơn các nhiệt độ tan chảy ™ của mồi sử dụng, trong khi ở các chu kỳ sau đó, nhiệt độ lại hạ thấp xuống một vài độ (3-5°C) dưới Tm của mồi. Nhiệt độ bắt cặp cao hơn cho phép tăng cao độ
đặc hiệu của việc bắt cặp, và nhiệt độ thấp hơn cho phép khuếch đại nhiều hơn hiệu quả từ các sản phẩm cụ thể được hình thành trong chu kỳ đầu tiên.
2.3.4.2. Kỹ thuật Realtime PCR
Trong sinh học phân tử, phản ứng realtime PCR hay phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực, còn được gọi là phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực (Q-PCR/qPCR/qrt-PCR) hoặc phản ứng chuỗi polymerase động (KPCR-Kinetic PCR), là một kỹ thuật phòng thí nghiệm dựa trên phương pháp PCR, đó là dùng để khuếch đại và đồng thời xác định số lượng một phân tử DNA đích. Nó cho phép cả hai việc phát hiện và định lượng (theo số lượng tuyệt đối hoặc tương đối các bản sao (copy) khi bình chuẩn hóa theo lượng DNA hoặc gen chuẩn hóa thêm vào) của một hoặc nhiều trình tự cụ thể trong một mẫu DNA.
Phương pháp này cũng theo nguyên tắc chung của phản ứng dây chuyền polymerase; tính năng chính của nó là các DNA được khuếch đại sẽ được phát hiện khi quá trình phản ứng đang diễn ra theo thời gian thực, là một phương pháp mới so với PCR tiêu chuẩn mà các sản phẩm của phản ứng chỉ được phát hiện khi kết thúc. Hai phương pháp phổ biến để phát hiện các sản phẩm PCR thời gian thực là: (1) loại không đặc hiệu gắn thuốc nhuộm huỳnh quang mà nó có thể gắn với bất kỳ sợi đôi DNA nào, và (2) loại gắn các mẫu dò (probe) DNA đặc hiệu bao gồm các oligonucleotides được gắn với một chất phát tín hiệu huỳnh quang mà nó cho phép phát hiện chỉ sau khi có sự lai ghép (bắt cặp) của mẫu dò với DNA bổ sung đích của mình.
Sự khác biệt cơ bản của phản ứng phản ứng Realtime-PCR so với PCR thông thường là: Khi phản ứng PCR kết thúc, cần phải tiến hành một công đoan nữa gọi là hậu PCR (Post-PCR), nghĩa là phải đọc kết quả bằng phương pháp điện di trên agarose; trong khi với Realtime PCR, không có bước hậu PCR này, vì khi phản ứng xảy ra, mọi tín hiệu đã được truyền từ máy PCR sang máy tính và thể hiện dưới dạng đồ thị quan sát được ngay trên máy tính. Chính vì điều này, mà người ta gọi nó là thời gian thực (Realtime). Thêm vào đó, phản ứng Realtime-PCR còn làm giảm được khả năng tạp nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm do bước hậu PCR gây ra.
Để hiểu Realtime-PCR hoạt động thế nào, chúng ta hãy xem đồ thị khuếch đại bên dưới. Trong đồ thị này, số chu kỳ của PCR thể hiện ở trục X, và tín hiệu huỳnh quang của phản ứng khuếch đại, tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm được
khuếch đại của phản ứng thể hiện ở trục Y. Đồ thị khuếch đại cho chúng ta thấy 2 pha, một pha nhân theo số mũ (exponentinal), và tiếp sau là một pha phẳng (plateau) không theo cấp số mũ. Ơ pha cấp số mũ, lượng sản phẩm PCR nhân gấp đôi mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng tiếp tục diễn ra, các thành phần phản ứng bị tiêu hao, và cuối cùng một trong số các thành phần đã hết. Ở thời điểm này, phản ứng chậm lại và bước vào pha phẳng.
Đầu tiên, huỳnh quang chỉ ở mức nền, và lượng huynh quang phát ra không thể phát hiện được (chu kỳ 1-18) mặc dù sản phẩm đang tích tụ theo cấp số mũ. Cuối cùng, lượng sản phẩm khuếch đại đầy đủ sẽ phát ra lượng tín hiệu huỳnh quan có thể phát hiện được. Số chu kỳ (vòng) mà ở đó điều này xảy ra được gọi là ngưỡng chu kỳ (hay ngưỡng vòng), hoặc Ct. Vì giá trị Ct được đo ở pha cấp số mũ khi thuốc thử chưa bị hạn chế, nên phản ứng realtime-PCR có thể được tính được chính xác và tin cậy lượng mẫu có trong phản ứng.
Giá trị Ct của phản ứng được xác định chủ yếu bởi lượng mẫu có khi bắt đầu phản ứng khuếch đại. Nếu một lượng mẫu trong phản ứng lớn, thì số vòng cần để tích tụ đủ lượng sản phẩm nhằm phát ra lượng huỳnh quang cao hơn mức nền sẽ tương đối thấp. Vì vậy, phản ứng sẽ có giá trị Ct thấp, hoặc sớm có Ct. Ngược lại, nếu lượng mẫu ít, thì cần phải nhiều chu kỳ hơn, và phản ứng sẽ có giá trị Ct thấp, hoặc lâu có Ct. Mối quan hệ này tạo nên cơ sở của khía cạnh định lượng của phản ứng Realtime-PCR.
PHẦN 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU